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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒提取浓度低，很多方法都试过了，求助大佬们解决方法
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学员CSJmmu

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒提取浓度低，很多方法都试过了，求助大佬们解决方法 已有3人参与

质粒提取浓度低，多的时候100ng/ul，少的时候只有20多。很多网上提示的点都改正过了。
菌是新从库存里划的，摇菌时间16小时左右，后来又把质粒转化之后重新划，再提取依然是没有提高。根据官网的信息，质粒是高拷贝。
抗生素浓度加倍过，也有在8小时左右的时候再加过一次（因为有人说氨苄会慢慢分解导致杂菌生长），也没有效果。
提取用的是天根的质粒小提试剂盒，菌液用了1.5毫升（主要是多了之后裂解效果不是很好，即使五分钟了也比较浑浊）
PW洗过之后有在室温放置5-10分钟以挥发酒精
EB buffer有提前65水浴过，加入洗脱液后室温放置2分钟，洗脱了两次。

另外偶尔有提取稍微高一点的时候就去酶切了，切胶回收效率更低。。。点样应该有1微克，但是收回后也就只有几纳克了。

因为这俩操作上有相似之处，所以想问问大佬们是不是我有哪种共性的错误导致两个实验效率都很低。
谢谢大家～
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1楼 2021-09-25 11:16:59
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kshdd

金虫 (著名写手)
我做的时候一般是过夜摇菌，取10ml左右离心得菌体，最后洗脱用70ul

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2楼2021-09-25 13:23:03
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轩辕佑德

至尊木虫 (职业作家)
换试剂盒

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Work hard，be kind,and amazing things will happen.
3楼2021-09-25 15:44:46
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网海一粟

铁杆木虫 (著名写手)
你用的什么扩增菌株？保存在表达菌株里的质粒或你把质粒转化到了表达菌株，那确实量少。如果这些信息不清楚，按你现在的做法，准备个1.5mLx5或更多的裂解上清，用同一根柱子吸附就行了。另外pw洗过后没必要放，延长离心时间到4分钟就行了，去酒精效果更好

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4楼2021-09-26 04:20:21
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网海一粟

铁杆木虫 (著名写手)
酶切，回收载体一般用2ug质粒，回收片段，看大小，小于1000bp的，保险一点就用4ug载体切吧

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5楼2021-09-26 04:23:17
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_Unicorn

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒浓度取决于质粒自身拷贝数，摇菌浓度等等，克隆载体等由于拷贝数高，往往1-2ml 就能提很高的浓度，表达载体则不一定。
建议就是多摇一些菌，多次离心后再提取。
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6楼2021-09-27 22:16:09
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小熊吃熊小

新虫 (初入文坛)
请问你的问题有解决吗？我最近提质粒的经历跟你差不多，质粒小提浓度两百多，大提浓度也是两百多
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7楼2022-04-22 11:17:16
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ScortRB

新虫 (初入文坛)
菌体量是不是有点少，我都是7mL小提
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8楼2022-04-24 16:56:50
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tybo

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主用的什么方法提取呀？可能的原因就是1、加样量是不是太少？2、如果是磁珠法，洗脱液的量是不是太多了？3、裂解不充分；欢迎楼主和我们上海领骏生物的技术进行沟通交流；也可以用用上海领骏生物的质粒DNA快速提取试剂(磁珠法)，我们实验室做的效果非常好；www.lnjnbio.com
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9楼2023-11-15 08:54:36
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AD_com

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

菌液太少，用4ml，洗脱的水不要小于50ul
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10楼2023-11-21 08:37:07
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