| 查看: 1540 | 回复: 1 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者张小蛋将赠送您 50 个金币 | ||
[求助]
pkD46敲除Red重组，出来的单菌落杂合，pCR结果显示既有敲除打靶片段又有原片段 已有1人参与
|
||
|
pkD46敲除Red重组，出来的单菌落杂合，pCR结果显示既有敲除打靶片段又有原片段 打靶片段是PCR产物，上同源臂200bp+下同源臂200bp+SacB Kana gene+下同源臂200bp （下同源臂出现两次是为了，第一次kana抗性筛选后，第二次蔗糖致死筛选，两个下同源臂之间发生二次重组） pKD46转入MG1655，挑单菌落30℃过夜培养，以1%接种量转接，30℃培养至OD=0.25，加30mM L-阿拉伯糖，继续培养至OD=0.5，冰浴30min，10%甘油洗三次，50ml菌液浓缩至100ul3-4支 打靶片段PCR纯化，DpnI消化，胶回收，浓度100-200ng/ul 4-5ul打靶片段电转化感受态，1mlLB重悬，30℃复苏2h，离心浓缩至200ul，涂布Amp+kana板，30℃，长出几十个菌落，但是菌落PCR发现，原有要敲得基因在，敲上去的打靶片段也在，而且送去测序了，测序证明都在，而且位置都对 也试过37℃复苏培养的，存在同样的问题 考虑是杂合，染菌，划线，传代培养，问题还是在 麻烦大家帮忙想想有什么好的解决办法？ 敲除验证引物，在待敲基因上游基因组300bp处，打靶片段SacB基因上，待敲基因下游基因组300bp处，菌落PCR结果都是对的,而且送去测序都是对的 麻烦大家多多帮忙啊~@biostar2009 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有205人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
lucklizhen
新虫 (正式写手)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 341
- 散金: 371
- 红花: 8
- 帖子: 383
- 在线: 182.6小时
- 虫号: 1437468
- 注册: 2011-10-11
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
2楼2022-04-21 15:51:00
