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张小蛋

新虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] pkD46敲除Red重组，出来的单菌落杂合，pCR结果显示既有敲除打靶片段又有原片段已有1人参与

pkD46敲除Red重组，出来的单菌落杂合，pCR结果显示既有敲除打靶片段又有原片段
打靶片段是PCR产物，上同源臂200bp+下同源臂200bp+SacB Kana gene+下同源臂200bp （下同源臂出现两次是为了，第一次kana抗性筛选后，第二次蔗糖致死筛选，两个下同源臂之间发生二次重组）
pKD46转入MG1655，挑单菌落30℃过夜培养，以1%接种量转接，30℃培养至OD=0.25，加30mM L-阿拉伯糖，继续培养至OD=0.5，冰浴30min，10%甘油洗三次，50ml菌液浓缩至100ul3-4支
打靶片段PCR纯化，DpnI消化，胶回收，浓度100-200ng/ul
4-5ul打靶片段电转化感受态，1mlLB重悬，30℃复苏2h，离心浓缩至200ul，涂布Amp+kana板，30℃，长出几十个菌落，但是菌落PCR发现，原有要敲得基因在，敲上去的打靶片段也在，而且送去测序了，测序证明都在，而且位置都对
也试过37℃复苏培养的，存在同样的问题
考虑是杂合，染菌，划线，传代培养，问题还是在
麻烦大家帮忙想想有什么好的解决办法？
敲除验证引物，在待敲基因上游基因组300bp处，打靶片段SacB基因上，待敲基因下游基因组300bp处，菌落PCR结果都是对的,而且送去测序都是对的
麻烦大家多多帮忙啊~@biostar2009

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