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潘小阳阳阳

新虫 (初入文坛)

[求助] 同源重组遇到的问题求助!已有2人参与

同源重组后,菌落长得不多,但是阳检全部正确,一排条带都对。但是送测之后要不显示未长菌要不就显示没连上,好几次了都这样,孩子心态真的崩了。各位哥哥姐姐求助sos!

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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

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假阳可能原因是涂了太多的东西在平板上,刮菌反应的时候把insert刮到了,然后PCR就出现了阳性结果

可以设计一个引物在质粒上,一个引物在insert上,这样能扩出条带,就应该是阳性的了

用传统的酶切连接方法试试? 或者做一下对照试验,看是不是试剂不work?
行至水穷处,坐看云起时
2楼2021-08-25 12:08:42
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myxmyhh

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同源重组效率会很高,一般成功重组上都是满板菌,这里考虑你PCR鉴定的引物不合适导致出现假阳性结果,而实际上并没有重组上。

跟楼上建议一样,采用Insert F 加上 Vector R 来进行菌落PCR。

另外,同源重组失败可以考虑同源臂GC含量的问题,建议检查一下自己的引物,如果引物没有问题则需要更换扩增Insert的模板。

最后,你同源重组失败但是长菌说明Vector并没有酶切干净,可以考虑加长酶切时间。
3楼2021-08-26 17:30:11
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