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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 同源重组遇到的问题求助！
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者潘小阳阳阳将赠送您 5 个金币

潘小阳阳阳

新虫 (初入文坛)

[求助] 同源重组遇到的问题求助！ 已有2人参与

同源重组后，菌落长得不多，但是阳检全部正确，一排条带都对。但是送测之后要不显示未长菌要不就显示没连上，好几次了都这样，孩子心态真的崩了。各位哥哥姐姐求助sos！

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1楼 2021-08-25 11:21:51
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
假阳可能原因是涂了太多的东西在平板上，刮菌反应的时候把insert刮到了，然后PCR就出现了阳性结果

可以设计一个引物在质粒上，一个引物在insert上，这样能扩出条带，就应该是阳性的了

用传统的酶切连接方法试试？ 或者做一下对照试验，看是不是试剂不work?
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2021-08-25 12:08:42
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myxmyhh

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同源重组效率会很高，一般成功重组上都是满板菌，这里考虑你PCR鉴定的引物不合适导致出现假阳性结果，而实际上并没有重组上。

跟楼上建议一样，采用Insert F 加上 Vector R 来进行菌落PCR。

另外，同源重组失败可以考虑同源臂GC含量的问题，建议检查一下自己的引物，如果引物没有问题则需要更换扩增Insert的模板。

最后，你同源重组失败但是长菌说明Vector并没有酶切干净，可以考虑加长酶切时间。
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3楼2021-08-26 17:30:11
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