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10大窍门，教你提高RNA抽取高得率！-北京百奥思科生物分享已有1人参与
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我们都知道，RNA提取过程中最重要的注意事项是防止RNA酶的污染导致实验失败，下面我们总结了一些实验技巧，以帮助提取更高质量的RNA。 总的来说做培养细胞的RNA提取比较容易，用普通的trizol（国内外均可），只要准备充分，操作的准确，这样提高RNA抽取高得率一般是没有什么问题的。 RNA提取失败经验总结 环境污染影响RNA提取。皮肤携带的细菌霉菌等微生物及人体自然脱落下来的皮屑，都可能成为RNA酶的来源，从而影响RNA的提取。因此要培养良好的无菌操作习惯，预防微生物污染。 操作时勤换手套，戴手套口罩，冰上操作，动作迅速。最关键的一步也是决定RNA质量的一步是：离心后，出现分层，RNA在上清中，中间是DNA,下面是蛋白。这里一旦不留意，中间的DNA就会混入，从而影响RNA质量。这里要提一个小技巧，为了提髙RNA的质与量，离心后不要马上吸取含有RNA的上清液，而是移取中层的DNA和下层的蛋白。余下的下层油相（10%~15%），经短暂高速离心之后再吸取上清含有RNA的水相。其实这一技巧可用于所有的分层液相的实验，如酚抽提DNA的实验，回收胶中DNA的实验。 对于组织而言，研磨是关键之一。在提取组织样品时，就得充分研磨组织，等组织块成为粉末后再加入Trizol试剂。常用的研磨方法是液氮研磨法。研磨后离心去处沉淀，不要在细胞离心后马上加入Trizol试剂。因为成团的细胞加入Trizol试剂后，外围细胞先期施放出的大分子DNA，聚积成团，干扰成团里层细胞的裂解，即使用加样*或针头反复吸取，也无法彻底打断已经成团的DNA。 研磨过程中有三个关键步骤： 研磨器皿高压灭菌烘干水汽后，-80放置过夜，预冷冻； 组织块的表面积尽可能大，切不可成球状，一旦用力研磨，球状的组织块极易飞出研钵； 加入足量的液氮让组织块完全冻透，一次将组织块研磨好。在没有冻透之前千万不能研磨，如一次没有研磨好，下一次研磨的效果就差，且第二次加入的液氮会将前一次所产生的干粉带出研钵，使其飞溅在研钵的四周。这一技巧同样可用于分离提取组织块的DNA或蛋白质。 使用Trizol试剂时，其中的一种成分能抑制RNA酶，所有RNA样品泡在Trizol试剂中是不可能被RNA酶消化的。但是，对样品的后续操作会要求用无RNA酶的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150的烘箱中烘烤4h。塑料器皿可以在0.5mol/L的NaOH中浸泡10min,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 用0.01%的DEPC或Erasol水溶解RNA时，原则上是要根据沉淀的多少加入相应的体积，考虑到新手一开始经验不足，可以少加，浓度大可以再稀释。提取完RNA后跑电泳检查有无DNA污染和RNA降解，然后-80保存。实验后要注意：超净台需用70%乙醇擦拭，再用DEPC或Erasol除去空气中的RNase，提取RNA所需的Tip和EP管要提前用0.1%的DEPC或Erasol水处理以除去RNase，DEPC处理还需高压。其实RNA贮存在70%的乙醇中，远远要比贮存于DEPC水中稳定，在-80可保存数年，有些甚至10多年后还可以用。 有两种操作方式： 乙醇或异炳醇沉淀后如不马上要用，直接换成70%乙醇，-80保存，用时再来分析RNA的质量和数量；常规的处理后，了解RNA的质和量，再加入3倍体积的无水乙醇，再-80保存。 当然，这两种贮存方式都要在RNA不是马上要用的前提下进行。如果提取的RNA比较多，可以先留取一部分样品进行马上进行的实验，另一部分贮存于70%乙醇，以备后用。 Trizol试剂提取RNA所用到的一次性试管要确保没有破损，能够耐受12000g的离心力。 实验用水相当重要，必须用DEPC处理过的无RNase水。配制过程是在去离子水中加入0.1%的DEPC,摇过夜之后，高压分解残留DEPC。。提取时，所有与Trizol试剂有过接触的器皿都要泡存水中，吸取出来的Trizol试剂也要直接加入含有大量水的玻璃杯中。 Trizol提取RNA时要注意戴手套和护眼罩，因为Trizol试剂含有酚等有机溶剂。操作要在通风橱完成，避免人呼吸道吸入。同时温度应该控制在15-30。 RNA抽提的10大窍门 快速組止Rnase活性。样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。 选擇合适的抽提方法。高核酵含量的绝织，脂肪组织最好用含本酚的方法。 预判质量要求。Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR，RPA(Ribonucleaseprotectionassay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酵抑制物残留)要求很高。 彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。 检查RNA的完整性。电泳28S:18S=2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。 去除DNA。用于RT-PCR，arrayanalysis最好用Dnase丨去除DNA。 降低外源酶的污染。不能从外面又导入酶。 低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。 彻底溶解RNA,必要时可以65℃加热5分钟。 合适的保存方法。短时间可以-20℃保存，长期请保存于-80℃。 提高RNA得率的方法 使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来，得率是会降低的。液氣捣碎、酵消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆，虽然麻烦，但都是获得高得率的有效手段。 抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起，则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后换厂家。另外，可以改用不使用苯纷、氯访提取的试剂方法；使用苯纷、氛仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的损失是比较大的。 延长沉淀时间。如果核酸浓度低，采取低温沉淀、并延长沉淀时间，可以获得非常好的效果。 RNA提取过程中最应该注意的就是RNA酶的防止，所有操作在超净台完成，然后一定要带一次性手套，而且一直要换。按规程操作，提高RNA高得率不是问题。 QQ:391956309 TEL:137*1827*9886 |
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