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yuebanwan金虫 (正式写手)
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PCR污染或药品问题
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1、在做转基因检测时，发现阴性对照及水也跑出条带来，开始以为是水的问题，换了还是存在；后来又以为是药品的问题，除了引物及酶都换了还是存在；后来，引物（743bp）也换了，还做了56、57、58。C三个温度，结果56是没有了，57、58还是有（且水的体系用的是早上56摄氏度时剩下的，中间间隔3~4h），何解？ 2、就是跑出来的，带也与预期的743bp大小不一样，大部分时候还在Marker的750bp带以上，为什么？ 3、有对引物（832bp）老是跑不出来，温度从54、55、56、57、58摄氏度五个梯度都P不出来，何故？ |
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liubing041
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2楼2009-08-18 09:33:32
xiaoyadxy
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1、在做转基因检测时，发现阴性对照及水也跑出条带来，开始以为是水的问题，换了还是存在；后来又以为是药品的问题，除了引物及酶都换了还是存在；后来，引物（743bp）也换了，还做了56、57、58。C三个温度，结果56是没有了，57、58还是有（且水的体系用的是早上56摄氏度时剩下的，中间间隔3~4h），何解？ --这个感觉是否是电泳上样有些问题，如果正常的话水是不会出现条带，上样小心样品飘出污染到旁边的孔，试试隔几个孔点，同时将电泳缓冲液更换新的，以前作出过什么都不加就有条带的电泳……另外对于PCR，不哟啊仅局限于调整退火温度，试试更换试剂等多种方法尝试实验后分析，我出现过dNTP 出问题检测了好久才找出来原因。或者重新合成引物，放久了也有失效的可能。 2、就是跑出来的，带也与预期的743bp大小不一样，大部分时候还在Marker的750bp带以上，为什么？ --这个不好确定原因，自己出现过这样的，但不是说这样的就能认为是正常结果，建议将条带回收测序验证下。 3、有对引物（832bp）老是跑不出来，温度从54、55、56、57、58摄氏度五个梯度都P不出来，何故？ --如果能保证试剂不出问题的话，试试再将退火温度降低，至45度左右，如果能出来，看条带是否有符合的，这时候非特异性条带会增多。如果不行，试试重新合成引物。 |
5楼2009-08-18 10:36:21
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vivihao
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