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网上找了一份基因枪法转化洋葱表皮的protocol，好多问题想问，求交流
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第一次做，啥也不懂，实验室也没有protocol，只能自己上网找了一份，但还是好多问题不明了，跪求各位大神解答（T-T） 材料准备：洋葱、质粒、金粉、MS培养基、无菌滤纸、无水乙醇、70%乙醇、亚精胺、离心管、可裂膜、载体膜、阻挡网 （这里有个问题：老师说只提供机器，让我们自己准备金粉等耗材，我想问一下，耗材除了金粉和可裂膜之外，还包括载体膜和阻挡网吗？） 洋葱表皮的获得： 购买新鲜的洋葱，用刀片和镊子取新鲜的内表皮 2 cm×2 cm 内层向下平铺在 MS 固体培养基上，用于基因枪轰击。 金粉的制备： （1）称取 30 mg金粉放入以 1.5 ml的离心管中； （2）加入 1 ml 70 %的酒精，充分涡旋震荡 15min，13000 rpm离心 3 min，去除上清； （3）重复步骤（2）一次； （4）加入 1 ml无菌水重悬沉淀，13000 rpm离心 3 min，去除上清； （5）重复步骤 4 二次； （6）加入 500μl无菌水重悬沉淀，-20°C 保存备用。 质粒的包埋： （1）将 10 μl 金粉 （60 mg/ml） ，0.5 μg 质粒、4μl 0.1M亚精胺和 8 μl 2 mol/L CaCl2 加入一个灭菌的离心管涡旋震荡 3 min； （2）放在冰上 10 min； （3）加入 140 μ l无水乙醇，充分涡旋震荡后，12000 rpm离心 10 s； （4）去掉上清液，加入 140 μ l 70% 乙醇，涡旋震荡后，12000 rpm离心 10 s； （5）去掉上清液，加入 200 μ l 100% 乙醇，将管放在冰上备用。 基因枪轰击： （1）将高压气体基因枪放置在一个较大型号的超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌 30 min以上； （2）用浸泡消毒法将可裂膜（Rupture disk, 1100 psi） 、载体膜（Macrocarrier） 、阻挡网（Stoppingscreen）于无水乙醇中消毒 15 min，然后置于无菌滤纸上，在超净台中吹干； （3）打开氦气体瓶阀，调节压力至 1300 psi （高压表头数值） ； （4）安装可裂膜于其托座上，顺时针拉到气体加速器上； （5）用 20 μ l移液器将 5 μl制备好的 DNA 子弹微粒滴于载体膜正中上，吹干； （6）将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环安装好，旋紧盖了，插入基因枪； （7）用镊子将样品皿放入基因枪样品室的样品架上，关好门； （8）按下真空开关，真空泵开始工作，当真空度达到 26-28 英寸汞柱时，即可按 hold 按钮，接着按发射钮并保持至听见气体冲破可裂膜的声音为止； （9）关闭真空按钮开关，按下真空释放按钮，使系统卸荷并将样品取出，这样一次基因导入试验完毕； （10） . 从阻挡板圆孔穴中取出载体膜， 接着拧下封口螺母， 从圆孔台上取出已经穿孔的可裂膜； （11）从步骤 4 开始重复操作，完成所有样品处理。 （12）关机：把氦气瓶总开关旋紧，打一次空枪，到氦气表指针回零后，在逆时针旋转氦压表调解阀，关闭基因枪的总幵关及变压器开关。 洋葱培养及观察： 将轰击过的洋葱表皮暗培养过夜，然后荧光显微镜下进行观察。 （有一个疑问：因为要观察的基因是定位在细胞膜上的，所以为了观察清楚，最好让细胞质壁分离。那我可不可以在过夜培养之后，把洋葱表皮放在载玻片上，然后用高浓度的蔗糖溶液去浸泡它呢？）@biostar2009 |
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