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繁梦倾城

新虫 (小有名气)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳拖尾，急求解决方案！ 已有1人参与

从肉葡萄球菌中提取质粒，跑电泳未出现质粒条带却严重亮带拖尾，请教大神这是为什么？
具体方法如下:
1.将肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)ATCC 51365培养12～16h，移取2mL菌液于EP管中，12000rpm离心2min，弃去上清液，用滤纸吸取残留的液体。加入100μL 50mg/mL的溶菌酶、20μL 1mg/mL溶葡萄球菌素于37℃、180rpm作用90min，然后按照传统提取质粒的方法提取肉葡萄球菌的质粒。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl Buffer P1(请先检查Buffer P1是否已经加入RNase A)，用移液器或涡旋振荡混匀。
3.向步骤2中加入250 μl Buffer P2，温和的上下颠倒混匀8 - 10 次，使菌体充分裂解。
?4.向步骤3中加入350 μl Buffer P3，立即温和地上下颠倒8 - 10次让溶液彻底中和Buffer P2。
5.将FastPure DNA Mini Columns吸附柱置于Collection Tube 2 ml收集管中。将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱中，注意不要吸到沉淀，12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。倒掉收集管中的废液，把吸附柱重新放回收集管中。
6.(可选)加入500 μl Buffer PW1 至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液，把吸附柱重新放回收集管中。
▲注意：如果宿主菌是end A+(TG1，BL21， HB101，JM系列， ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α，TOP10等)，此步可省略。
7.加入600 μl Buffer PW2(请检查是否已用无水乙醇稀释)至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8.重复步骤7。
9.将吸附柱放回收集管中。12,000 rpm(13,400 × g)离心1 min干燥吸附柱，目的是将吸附柱中残留的漂洗液彻底去除。
10. 把吸附柱置于一个新的灭菌的1.5 ml 离心管中。加入30 - 100 μl Elution Buffer 至柱吸附柱的膜中央。室温静置2 min，12,000 rpm(13,400 × g）离心1 min洗脱DNA。
11. 弃去吸附柱，DNA产物保存于-20℃，以防止DNA降解。
Ps:但是第6步没有做，不知道有没有关系

琼脂糖凝胶电泳拖尾，急求解决方案！


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1楼 2021-06-22 16:26:30
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周东浩129

新虫 (正式写手)
请问楼主构建好的载体转化进et12567里面，多久会降解啊，

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5楼2022-01-11 12:57:51
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ahsoarli

捐助贵宾 (职业作家)

骑牛逛街
拖尾就是降解了

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方而不割廉而不刿直而不肆光而不耀
2楼2021-06-23 09:01:13
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繁梦倾城

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ahsoarli at 2021-06-23 09:01:13
拖尾就是降解了

谢谢回复，我还想问下这有可能是因为提质粒的过程中降解了吗

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3楼2021-06-23 16:14:31
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jmqt7140

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2021-12-23 13:46:09
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