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刘加油

新虫 (初入文坛)

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[交流] 构建载体已有3人参与

请教各位大佬连接有什么好方法吗？我目的基因双酶切T4连接pet26b，pcold-tf，pgex-4t三个载体，三个月了都没有一个连接上的，好痛苦啊！

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1楼 2021-06-19 16:11:58

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原海亮

木虫 (著名写手)

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你描述的实验数据还是太有限了，所以很难帮你具体分析是哪里出了问题，你可以了解一下基因克隆的各要素，然后以下思路去试着解决：

1、目的基因方面

   你没有提及你的目的基因来源，是通过pcr获得的？还是其他载体上切下来的？还是直接基因合成的？

   如果是目的基因PCR获得的产物，本身PCR产物两端酶切位点外只有几个保护碱基，直接对pcr产物双酶切会有一些问题，一方面不容易酶切完全，另一方面是否酶切完全比较难以检测（电泳分辨率达不到几bp），所以为了保险起见，可以将pcr产物先连接T载体上，进行测序验证后，在用双酶切从T载体上面将目的基因切下来，这样也可以使用电泳检测来辨别目的基因是否酶切完全（pcr片段只有酶切完全才可以和T载体分离），这样胶回收得到的目的片段，一般都是双酶切完全的目的基因。

   这里提醒一下，在胶回收得到目的基因后，一定对获得的目的基因进行电泳检测，一来避免胶回收失误导致没有获得目的基因，然后也可以确定一下回收的目的基因的浓度。

2、载体的处理

   相对于目的基因，载体的处理会影响菌落假阳性的数量，未酶切完全的载体可能会出现自连，实验室里面通常对载体处理的经验是，首先看看同样的载体，同样的酶切位点，实验室里有没有已经构建好的其他基因的重组载体？我们知道如果从一个pet26空载体（其他载体同理）出发进行双酶切处理，这个和直接PCR产物酶切是一个道理，是否酶切完全很难检测确认。那么如果以实验室已有的重组载体（比如pet26-A基因）作为出发载体双酶切，相对就容易判断载体是否酶切完全了（胶回收后电泳检测）。

   如果实验室没有这样的载体，只能通过控制载体酶切条件以及连接反应中载体的添加量来提高试验效率（你也没有提及没有连上一个具体是怎么样的试验结果，是没有一个菌落生长？还是有菌落生长但都是假阳性？这两个现象是可以帮助你推测可能的原因的）。

3、连接体系

   连接体系里主要有双酶切的片段，双酶切的载体，连接酶体系，这里默认你的商业连接酶体系是OK 的（你可以自行确认），那么控制片段和载体的浓度比是可以适当提高连接效率及阳性率的，可以建议你尽可能都得加入你的目的基因，微量的载体，毕竟片段多了在抗性筛选的时候即被淘汰，但载体多了就容易出现自连空载等情况导致假阳性。我们宁可长10个菌都是阳性，也不愿长上千个菌都是假阳性的。

4、转化系统

   看你使用的载体应该是大肠杆菌的常用载体，大肠杆菌的感受态及转化方法非常成熟了，默认你的这些材料和技术是没有问题的，那么下次你进行转化的时候，应该加入一个阳性对照（比如你实验室已有的重组载体pet-A）和阴性对照，来确认转化系统OK。

5、阳性克隆筛选

   阳性克隆筛选的方法就很多了，但是比较有说服力我推荐是提取质粒双酶切验证。

6、基因功能方面

   应该去了解一下你的目的基因或蛋白的可能功能，有一些毒性蛋白可能会影响宿主的生理代谢甚至杀死宿主，导致虽然转化成功，但是菌体无法正常生长的情况。

   以上的都是默认在你实验设计及人为操作没有问题的情况下分析的，比如你要确定你的酶切位点设计没问题，你的抗性选择没出现错误等等，另外实验结果的描述太过于简单，没有办法具体分析，可以适当增加每步的实验结果现象，有助于问题的解决，祝好！