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T载体连接与连接产物转化感受态细胞 已有2人参与
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转化的感受态细胞长不出来，希望大家帮忙分析一下可能是哪里出了问题。 转录组测序分析回来的结果是，一个基因长度为697bp，另一个基因长度为660bp。最后扩增出来的条带均在1kbp附近，且无其他明亮条带。回收浓度分别为37和39 。T载体使用艾德莱的“零背景pTOPO—Blunt Simple平末端克隆试剂盒”，试剂盒刚刚到是新的。感受态细胞使用购买的维地DH5α。做了三次了，延长培养时间至18h，延长连接时间（说明书是5min），严格把控热激时间，但是最后板子上连个杂菌都没有。。。希望哪位大神帮忙分析一下可能是什么问题 |
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原海亮
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【答案】应助回帖
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根据你的描述，可以从以下思路考虑： 1、PCR体系方面，关于你说的“转录组测序分析回来的结果是，一个基因长度为697bp，另一个基因长度为660bp。最后扩增出来的条带均在1kbp附近，且无其他明亮条带”，没有看太懂什么意识，姑且认为你是想表达目的条带没有问题吧。 使用的是平末端T克隆试剂盒，楼主应确认一下你PCR使用的酶是否合适？是不是也应该用PCR产物为平末端的聚合酶？粘性末端的酶是不是应该处理成平末端或是否需要磷酸化？（试剂盒里面应该有介绍）。 2、连接或转化体系方面，平末端的T载体应该比较难自连的，基本上平板要不不长菌，要不就是阳性克隆，假阳性概率比较低（载体自连造成）。所以你一直没有菌生长，可能是片段处理或者转化的问题，试剂盒里面一般有阳性对照样品，你可以下次实验时候做一个阳性对照和一个阴性对照，验证一下是不是试剂盒或者转化条件的问题（也可以和试剂盒公司的技术支持人员沟通交流一下使用技巧）。 3、确认一下平板抗性是否正确或者抗生素是否有问题。 4、T载克隆是比较常常用的一个实验技术，因其简单易操作（PCR产物可以不用酶切直接连T载体），一般会用于做亚克隆前的PCR片段测序，片段的酶切处理或者酶切位点的替换（PCR产物直接双酶切不易验证是否酶切完全，连了T载体后再酶切易确认片段是否被酶切完全）等。 但是T载体克隆并不是基因克隆过程中必须的实验步骤，现在很多的分子生物学研究人员基本上不用T载体克隆，直接进行片段处理后与目标载体连接，测序等。 所以如果工作在此停滞太久，耽误实验进程，把简单的事情搞的复杂化了，也就体现不出来T克隆的优势作用，那么完全可以考虑更换一个T克隆试剂盒，甚至可以直接跳过T克隆，直接进行目的载体的克隆连接。 祝好！ |
2楼2021-06-07 11:23:14
3楼2021-06-09 17:29:36
