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feitiannongying

铁杆木虫 (著名写手)

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[交流] 原核表达及诱导

导师给的课题是将拟南芥一个膜蛋白基因构建到原核表达载体进行体外诱导表达。我用的表达载体是pET30a，然后转到BL21（DE3）中进行诱导表达。在BL21（DE3）中进行诱导表达时，诱导时间用过3h、4h、5h、6h、8h，IPTG浓度用过15uM 、300uM 、500uM 、800uM、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达时，诱导时间用过4h、6h、，IPTG浓度用过15uM 、500uM 、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在这两种宿主菌中诱导后跑SDS-PAGE发现转化子的和空载体的跑出的条带没有任何差别。重组载体没问题，测序正确并且没有移码。
从今年的3月份实习一直到现在我都在做这个课题，从一开始实验就很不顺利，到七月份才做到原核表达，而到现在还没表达出来，真的快要疯了，恳请有经验的师兄师姐给指点一下。谢谢！！

[ Last edited by amisking on 2009-8-18 at 22:12 ]

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1楼2009-08-13 09:28:50

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magicsite

木虫 (正式写手)

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feitiannongying(金币+5,VIP+0):谢谢！！ 8-14 09:40
feitiannongying(金币+2,VIP+0): 10-11 07:08

引用回帖:

Originally posted by xiaoyur at 2009-8-13 22:09:

1, 很可能信号肽影响表达。我曾经表达一个蛋白，用了很多载体和菌株都不行，最后去掉信号肽很容易就表达出来了。你表达的膜蛋白一般应该有信号肽。
2，仔细看看NOVAGEN公司的《原核表达手册》。网上有电子版的 ...

1.是否具有信号肽建议通过结合信号肽预测和亲疏水性分析最终判断；
2.可能你还得考虑跨膜域的影响，膜蛋白可能会具有跨膜域，会影响在原核中的表达
3.的确应该仔细看看NOVAGEN公司的《原核表达手册》。