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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】β-actin P不出来，求教原因，急！
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xu_hai

铁杆木虫 (职业作家)

[交流] 【求助】β-actin P不出来，求教原因，急！

我提取的是青鳉鱼的脑组织RNA
实验操作：

1、变性退火反应：
         65℃     5min
         pause
        取出迅速置于冰上
2、反转录反应：
        42℃     30min
        70℃     15min
        4℃        Hold
3、PCR反应
         94℃    2min
         94℃    30s
         55℃    30s
         72℃    1min
        （30个循环）
         72℃    5min
         12℃    Hold
         end

β-actin长度为540bp，电泳后什么都没有，很是郁闷啊，请问哪位大侠能够点拨一下？不甚感激。注：RNA提取应该没有问题。

[ Last edited by xu_hai on 2009-8-11 at 09:20 ]
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1楼 2009-08-10 20:51:25
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yongpwen09

为什么不用常规PCR产物当模板呢

★
xu_hai(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-11 09:18
为什么不用常规PCR产物当模板呢
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2楼2009-08-10 22:39:40
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-11 09:18
用别的引物看看你的模板有问题不？如果模板没问题，就可能是 actin引物设计的问题了。
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3楼2009-08-11 03:40:22
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xu_hai

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by michaelwuqingyu at 2009-8-11 03:40:
用别的引物看看你的模板有问题不？如果模板没问题，就可能是 actin引物设计的问题了。

引物用的是文献上给的
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4楼2009-08-11 20:18:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0):有道理啊，我再试试，但能详细说下RNA会出啥问题呢？ 8-12 21:35
种属对吗？如果种属ok那么就是逆转录或者RNA出了问题
赞一下(3人) 回复此楼
5楼2009-08-11 20:59:34
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0): 8-12 21:36
引用回帖:
Originally posted by xu_hai at 2009-8-11 20:18:


引物用的是文献上给的

千万别信文献上的，我用NATURE上面文章的引物都没P出来，以我的经验，80%照搬文献的引物都P不出来，还是自己设计吧。
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6楼2009-08-11 22:32:16
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ideal9268

铜虫 (小有名气)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0): 8-12 21:36
要不做个降落试试？
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7楼2009-08-11 22:40:48
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pigsunny

铜虫 (小有名气)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0): 8-12 21:36
这个地方的原因很多的，你自己先摸索一下，比如PCR条件等等
赞一下(2人) 回复此楼
学习成就未来！
8楼2009-08-11 23:18:31
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★
xu_hai(金币+1,VIP+0): 8-12 21:36
上数据库搜索以下看看是否有现成的序列，如果没有就把有的序列进行一下比对，找保守区，设计引物继续往下做
赞一下(2人) 回复此楼
会当凌绝顶，一览众山小
9楼2009-08-12 01:52:43
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xu_hai(金币+1,VIP+0):我测RNA含量了，达到6点几，但就是OD值比较小，只有1.4-1.5，是这个原因吗 8-12 22:04
re楼主
如果RNA没提好，比如降解了，自然就很难P
赞一下(2人) 回复此楼
10楼2009-08-12 21:48:26
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