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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：POD酶的测定
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skywalkerelf

银虫 (小有名气)

[交流] 求助：POD酶的测定

我最近在测植物中POD酶的含量，采用的方法如下：称取5.0g植物叶片，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g离心10min，上淸液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml PBS缓冲液再提取两次，上淸液并入容量瓶中，定容至刻度低温下保存备用。酶活性测定的反应体系包括：2.9mlPBS缓冲液、1.0ml2%H2O2、1.0ml0.05mol/L愈创木酚和0.1ml酶液，用酒精灯加热煮沸的酶液为对照。470nm波长下比色，每隔1min记录一次吸光度，共记录5次。
我不知道这个方法是否有缺陷，每次在煮沸对照酶液的时候，原本透明的对照酶液一经加热，就会变成淡淡的乳白色，然后以它为对照，在紫外分光光度计上测定别的样品液的时候，样品液的吸光值就是负值，而且样品液在试管中没有问题，可是倒入比色皿、放入紫外分光光度计中后，就会产生很多小气泡，也不知道该怎么处理，请问大家有什么好的方法吗？就是1.解决POD酶含量的测定问题；2.解决比色皿中不断产生小气泡的问题。多谢多谢！

[ Last edited by skywalkerelf on 2009-8-10 at 11:12 ]
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1楼 2009-08-10 11:05:05
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-10 13:34
测POD可以不用空白的，直接记录样品OD470的变化最后算出单位时间的变化值就可以了

有气泡是有反应的结果吧，正常的现象是溶液变红，楼主没有看到？
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2楼2009-08-10 13:18:46
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skywalkerelf

银虫 (小有名气)
没有，几乎都没有颜色，我也不知道什么地方出问题了。还有，你说有气泡是反应的结果，但是那个气泡是一直持续生成的，越来越多，有什么方法处理吗？

[ Last edited by skywalkerelf on 2009-8-10 at 15:44 ]
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3楼2009-08-10 15:43:05
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greatsun

木虫 (正式写手)
样品液的吸光值就是负值？？不会吧？会不会是你的空白没有弄好？？

POD的检测方法很多，如果不行，可以换用其他方法试试。
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4楼2009-08-10 18:24:41
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晴空一鹤

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果比色皿中无颜色变化，有可能是你所配的酶促反应体系中愈创木酚和过氧化氢的问题。建议参照李合生或张志良的实验指导书
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5楼2009-08-10 23:09:12
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by skywalkerelf at 2009-8-10 15:43:
没有，几乎都没有颜色，我也不知道什么地方出问题了。还有，你说有气泡是反应的结果，但是那个气泡是一直持续生成的，越来越多，有什么方法处理吗？

[ Last edited by skywalkerelf on 2009-8-10 at 15:44 ]

气泡就是越来越多啊，不断生成说明酶活很高，所以酶液肯定没有问题，颜色无变化可能就是愈创木酚的问题
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6楼2009-08-10 23:16:56
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蓝皮鼠7983
7楼2009-08-11 00:31:18
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小太阳3369

木虫 (著名写手)

悠悠我心
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
实验原理大同小异，考虑换其他方法，或者用药剂量
POD活性相对来说比较好测定的，颜色变化也是逐渐变深的
祝实验顺利
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(*^__^*)嘻嘻……
8楼2009-08-11 09:53:49
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