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wilsonismal

新虫 (初入文坛)

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虫号: 4487938
注册: 2016-03-10
专业: 生物化学

[求助] 质粒构建过程中，载体上基因大量丢失

各位大佬们，我想将潮霉素抗性基因（1400 bp）连接到一个具有氨苄抗性的载体上（6000 bp）
我是先将载体通过XbaI-HindIII双酶切，切除一个900 bp左右的片段，进行线性化，并通过胶回收进行回收，回收的线性化载体（5000 bp），测序后结果符合预期
潮霉素基因通过PCR进行扩增，扩增后通过消化和PCR回收进行纯化，测序后结果也符合预期
潮霉素基因和线性化的片段分别使用T4 和同源重组进行连接，并分别转化入BL21，Trans10和JM109感受态，并使用有潮霉素和氨苄的抗性平板进行筛选
12小时后，挑取单菌落进行菌落PCR（引物位置在潮霉素基因上），结果呈阳性
挑取阳性菌在含有潮霉素和氨苄的液体LB培养基后培养12小时，提取质粒，并进行sanger测序（测序引物在潮霉素基因两端载体上），结果测序失败，然后使用氨苄通用引物对质粒进行测通，发现质粒长度仅有3900 bp，与预期中连接后6500 bp不符，经比对后发现，质粒中仅保留了质粒的Ori，氨苄抗性（AmpR）和潮霉素抗性（Hygr）区域，其他地方都没了
请问有人遇见过这种问题吗，怎么解决啊

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