| 查看: 1041 | 回复: 0 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者模子若松将赠送您 25 个金币 | ||
[求助]
PCR点突变质粒相关疑问
|
||
|
我现在在做单点突变的质粒，是利用PCR去实现的。 现在有两种做法： 1.直接上下游设计引物，上游为突变位点三个碱基带两边各15bp，下游为突变位点前30bp。primestar 的fastpfu使用，以质粒或者菌液为模板去扩增。然后直接往商用感受态转化.整体载体使用的是pet30a带T7启动子终止子，共6000多bp，目的片段为1176bp。95 5 95 18s 55 18s 72 3.30m。 2.第二，按照之前的体系，但单独加入单引物进行单引物pcr，加入的质粒小于50ng，后加入dpn I消化一小时。后混合，94 10m ，37 40m孵育。 使用的抗性为卡那抗性。 想问的有三个问题： 1.这样的方法是否存在原模板未消化干净之外的假阳性？ 2.方法一会产生部分无法自连的两段带有引物同源片段的长链，约6000bp也是，这个转入后是否会产生抗性？ 3.菌落pcr有时能做出，有时候不能，是否做不出来就代表是假阳性？有的之前做出来了测序有结果是对的，挑取后摇起来，菌液直接做pcr结果没结果。送菌液或者自己提取质粒后送测序是否更好？ 4.这个质粒能在菌里大概保存几代?不会我今天测序，明天挑了摇起来就没有了吧。摇起来后能否就用摇起来的菌再传代提质粒 ？ |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有81人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复