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PCR点突变质粒相关疑问
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我现在在做单点突变的质粒，是利用PCR去实现的。 现在有两种做法： 1.直接上下游设计引物，上游为突变位点三个碱基带两边各15bp，下游为突变位点前30bp。primestar 的fastpfu使用，以质粒或者菌液为模板去扩增。然后直接往商用感受态转化.整体载体使用的是pet30a带T7启动子终止子，共6000多bp，目的片段为1176bp。95 5 95 18s 55 18s 72 3.30m。 2.第二，按照之前的体系，但单独加入单引物进行单引物pcr，加入的质粒小于50ng，后加入dpn I消化一小时。后混合，94 10m ，37 40m孵育。 使用的抗性为卡那抗性。 想问的有三个问题： 1.这样的方法是否存在原模板未消化干净之外的假阳性？ 2.方法一会产生部分无法自连的两段带有引物同源片段的长链，约6000bp也是，这个转入后是否会产生抗性？ 3.菌落pcr有时能做出，有时候不能，是否做不出来就代表是假阳性？有的之前做出来了测序有结果是对的，挑取后摇起来，菌液直接做pcr结果没结果。送菌液或者自己提取质粒后送测序是否更好？ 4.这个质粒能在菌里大概保存几代?不会我今天测序，明天挑了摇起来就没有了吧。摇起来后能否就用摇起来的菌再传代提质粒 ？ |
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