| 查看: 945 | 回复: 0 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者模子若松将赠送您 25 个金币 | ||
[求助]
PCR点突变质粒相关疑问
|
||
|
我现在在做单点突变的质粒，是利用PCR去实现的。 现在有两种做法： 1.直接上下游设计引物，上游为突变位点三个碱基带两边各15bp，下游为突变位点前30bp。primestar 的fastpfu使用，以质粒或者菌液为模板去扩增。然后直接往商用感受态转化.整体载体使用的是pet30a带T7启动子终止子，共6000多bp，目的片段为1176bp。95 5 95 18s 55 18s 72 3.30m。 2.第二，按照之前的体系，但单独加入单引物进行单引物pcr，加入的质粒小于50ng，后加入dpn I消化一小时。后混合，94 10m ，37 40m孵育。 使用的抗性为卡那抗性。 想问的有三个问题： 1.这样的方法是否存在原模板未消化干净之外的假阳性？ 2.方法一会产生部分无法自连的两段带有引物同源片段的长链，约6000bp也是，这个转入后是否会产生抗性？ 3.菌落pcr有时能做出，有时候不能，是否做不出来就代表是假阳性？有的之前做出来了测序有结果是对的，挑取后摇起来，菌液直接做pcr结果没结果。送菌液或者自己提取质粒后送测序是否更好？ 4.这个质粒能在菌里大概保存几代?不会我今天测序，明天挑了摇起来就没有了吧。摇起来后能否就用摇起来的菌再传代提质粒 ？ |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有140人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复