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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求各位帮帮忙——关于基因克隆
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msj8574

[交流] 求各位帮帮忙——关于基因克隆

一个基因我整了半年，到现在全长还没克隆出来。
具体情况是这样的：我得到的保守区域有306个bp，根据这个保守区设计特异引物分别扩增3'端和5'端，3'端用3'RACE的方法扩增，5'端用染色体步移法，扩增出来的3'端和5'端片断与保守区重叠的部分各有80多个bp，我认为这可能就是一个基因的两端了，于是拼接后扩全长，但是扩不出来。后来设计的特异引物放在了离两端更远的位置，但似乎保守区太保守，总得不到想要片断。
请问各位，我这保守区是不是太短了？
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1楼 2009-08-03 09:55:04
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-3 15:58
3'端和5'端以及保守区已经能够拼接出来了，只是不能扩出来，这很可能是扩全长的引物的问题，跟保守区长短关系不大吧？还有，“保守区太保守”是“总得不到想要片断”的必要条件吗？这个我不很懂。
建议您重新设计扩全长的引物。
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
2楼2009-08-03 11:04:31
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msj8574

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):说的很有道理！ 8-3 22:18
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2009-8-3 11:04:
3'端和5'端以及保守区已经能够拼接出来了，只是不能扩出来，这很可能是扩全长的引物的问题，跟保守区长短关系不大吧？还有，“保守区太保守”是“总得不到想要片断”的必要条件吗？这个我不很懂。
建议您重新设计 ...

谢谢您的建议。
关于“‘保守区太保守’是‘总得不到想要片断’的必要条件吗？”我不知道‘保守区太保守’这个表达正不正确。我这个基因属于一个很大的基因家族，我后来根据保守区设计的特异引物所扩增出的片断用DNAMAN比对分析，本来应该与保守区重叠的区域，总是有部分碱基不吻合。就是说，扩增到了家族中其它的基因的片断，3'端和5'端都是这样的。所以我想是不是我设计的引物序列恰好在家族中的多个基因中都存在。
注：我扩增时都用巢式PCR，但电泳检测并非是单一条带，我切胶时都切最亮的那个。
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3楼2009-08-03 11:59:38
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-3 21:49
我明白您的意思了。
你可能是觉得现在这个3'端和5'端不是一个基因的，是这个家族不同基因的，因此扩不出全长。你可以用高保真酶扩3'端和5'端，对3'端和5'端序列多测一些克隆，选重叠区域完全一样的拼全长，然后再设计扩全长的引物。如果还是像你说的那样，保守区太保守，非保守区不保守，再想其他办法。
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4楼2009-08-03 19:06:02
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zibeisha

木虫 (著名写手)
★
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呵呵，刚开始做这方面，很多问题也是不太懂，多多交流啊！
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
5楼2009-08-03 19:53:07
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baiyidao

金虫 (小有名气)
★
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你没有参考序列ma？设计的引物进行BLAST了么？一定找特异性高的引物进行扩增。
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6楼2009-08-03 21:38:04
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chg952

金虫 (小有名气)
i学习一下搞手
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7楼2009-08-03 21:52:28
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msj8574

谢谢香菱儿，“你可以用高保真酶扩3'端和5'端”这个我要试一下。
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8楼2009-08-03 22:22:08
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msj8574

引用回帖:
Originally posted by baiyidao at 2009-8-3 21:38:
你没有参考序列ma？设计的引物进行BLAST了么？一定找特异性高的引物进行扩增。

弱弱问一下，引物怎样进行BLAST啊？
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9楼2009-08-03 22:24:25
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superarm

金虫 (正式写手)
★
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多设计几条，如果这个基因变异比较大的话，就是SNP比较多的话，就有可能扩增不出片段。
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与分子生物学的同仁一起遨游科学的海洋！
10楼2009-08-04 09:16:42
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