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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求各位帮帮忙——关于基因克隆
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msj8574

[交流] 求各位帮帮忙——关于基因克隆

一个基因我整了半年，到现在全长还没克隆出来。
具体情况是这样的：我得到的保守区域有306个bp，根据这个保守区设计特异引物分别扩增3'端和5'端，3'端用3'RACE的方法扩增，5'端用染色体步移法，扩增出来的3'端和5'端片断与保守区重叠的部分各有80多个bp，我认为这可能就是一个基因的两端了，于是拼接后扩全长，但是扩不出来。后来设计的特异引物放在了离两端更远的位置，但似乎保守区太保守，总得不到想要片断。
请问各位，我这保守区是不是太短了？
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1楼2009-08-03 09:55:04
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-3 15:58
3'端和5'端以及保守区已经能够拼接出来了，只是不能扩出来，这很可能是扩全长的引物的问题，跟保守区长短关系不大吧？还有，“保守区太保守”是“总得不到想要片断”的必要条件吗？这个我不很懂。
建议您重新设计扩全长的引物。
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
2楼2009-08-03 11:04:31
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-3 21:49
我明白您的意思了。
你可能是觉得现在这个3'端和5'端不是一个基因的，是这个家族不同基因的，因此扩不出全长。你可以用高保真酶扩3'端和5'端，对3'端和5'端序列多测一些克隆，选重叠区域完全一样的拼全长，然后再设计扩全长的引物。如果还是像你说的那样，保守区太保守，非保守区不保守，再想其他办法。
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
4楼2009-08-03 19:06:02
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