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hyy的笑

铁虫 (小有名气)

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[求助] HPLC：乙腈/水梯度洗脱，乙腈比例增大后吸光度降低。已有1人参与

各位大神，求助HPLC问题。
最近用HPLC测定苯酚，用的Kinetex 5u C18 100A的柱子，安捷伦的机子。
采用乙腈和水梯度洗脱：0-5 min 乙腈/水=20/80，也是这个比例调谐的；5-15 min 乙腈/水=95/5；15-20 min 乙腈/水=20/80。
刚开始的时候运行很正常，如图所示，当乙腈比例开始增大后UV的吸光度也有一点攀升。但是这周测试时发现当乙腈比例开始增加时，UV的吸光度开始变负，而苯酚正常出峰（如图：不是倒峰），算的浓度也正常。
想咨询一下各位大神这到底是出了什么问题？（压力正常，柱子也没问题，拆了柱子空着运行时，只要加大乙腈的比例吸光度就开始往负走）同一台机子，用低浓度硫酸做流动相测乙酸是完全正常。

我该怎么办。

@学术巨星 @wyy080214 @superyeast @klicking 发自小木虫Android客户端

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1楼 2021-03-05 18:55:25

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hexued6933

版主 (著名写手)

日出东方，岂能不败

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

乙腈-水体积的基线，和pH有很大关系。由于波长较低，造成基线不一致的情况有以下可能：
1. 不同天水的pH不一样。
2. 之前体系用了具有紫外吸收的流动相比如乙酸、甲酸等，体系不干净，造成基线漂移。估计你多数是第二种情况。冲冲系统就好了

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hyy的笑

大家好，才是真的好

2楼2021-03-06 13:21:14

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hyy的笑

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引用回帖:

2楼: Originally posted by hexued6933 at 2021-03-06 13:21:14
乙腈-水体积的基线，和pH有很大关系。由于波长较低，造成基线不一致的情况有以下可能：
1. 不同天水的pH不一样。
2. 之前体系用了具有紫外吸收的流动相比如乙酸、甲酸等，体系不干净，造成基线漂移。估计你多数是 ...

非常感谢你的回答。现在测纯水也是当乙腈比例增大后往负了跑，所以应该不是第一种情况。第二种可能，我的确是有时候测乙酸，有时候测苯酚（柱子不一样），但是这次出现这种情况后前前后后冲洗了两三天，也试着升温冲洗看是有什么难溶的物质没有，结果还是没啥变化