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小汰宝金虫 (正式写手)
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RBS+第一个蛋白（有终止密码子）+第二个蛋白（有终止密码子），会正常表达吗？已有1人参与
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想构建2个蛋白在pet28a载体上。序列大概是： T7启动子——RBS——第一个蛋白（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子） 第二个蛋白前是没有RBS的 请问这样第二个蛋白能正常表达吗？还是第二个蛋白表达量会少一点？还是第二个蛋白因为没有RBS所以根本不会有表达？ 求助，感谢。 |
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pennchem
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2楼2021-02-06 10:03:07
小汰宝
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太感谢了！ 我是在构建一个融合蛋白突变库的时候，找到一个突变体，效果特别好，但是测序发现这个突变体序列在in fusion连接的时候发生了错配，完全没有按我们预计的走，却表现出了较高的蛋白2的酶活和极少的包涵体，所以很困惑。 设计的融合蛋白突变库的构建： T7启动子——RBS——第一个蛋白做随机突变（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子） 找到的这个的hit: T7启动子——RBS——第一个蛋白，有随机突变，但是大约只有原蛋白前3/4部分（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第一个蛋白有随机突变，但是大约只有原蛋白前1/2部分（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子） 这个hit等于变成了我题目中问的那个样子。 测序应该没有问题，此序列来自双向测序结果。 这个hit做蛋白2的催化，表现非常好。现在不知道怎么解释这个机理机制，毕竟原以为发生这种错连的突变，蛋白2应该没表达才对。 |
3楼2021-02-06 10:17:15
pennchem
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4楼2021-02-06 10:29:19