应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » RBS+第一个蛋白（有终止密码子）+第二个蛋白（有终止密码子），会正常表达吗？
51/1返回列表
查看: 2768  |  回复: 3
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者小汰宝将赠送您 5 个金币
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小汰宝

金虫 (正式写手)

[求助] RBS+第一个蛋白（有终止密码子）+第二个蛋白（有终止密码子），会正常表达吗？ 已有1人参与

想构建2个蛋白在pet28a载体上。序列大概是：

T7启动子——RBS——第一个蛋白（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

第二个蛋白前是没有RBS的

请问这样第二个蛋白能正常表达吗？还是第二个蛋白表达量会少一点？还是第二个蛋白因为没有RBS所以根本不会有表达？


求助，感谢。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2021-02-05 22:28:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小汰宝

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2021-02-06 10:03:07
翻译蛋白，需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点（ribosome binding site），核糖体结合的可能性会低很多，意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒，插入MCS1和MCS2就可以同时表达两 ...

太感谢了！

我是在构建一个融合蛋白突变库的时候，找到一个突变体，效果特别好，但是测序发现这个突变体序列在in fusion连接的时候发生了错配，完全没有按我们预计的走，却表现出了较高的蛋白2的酶活和极少的包涵体，所以很困惑。

设计的融合蛋白突变库的构建：
T7启动子——RBS——第一个蛋白做随机突变（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

找到的这个的hit:
T7启动子——RBS——第一个蛋白，有随机突变，但是大约只有原蛋白前3/4部分（有终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第一个蛋白有随机突变，但是大约只有原蛋白前1/2部分（无终止密码子）——78bp （血清酶切割位点和T7 tag）——第二个蛋白（有终止密码子）

这个hit等于变成了我题目中问的那个样子。

测序应该没有问题，此序列来自双向测序结果。

这个hit做蛋白2的催化，表现非常好。现在不知道怎么解释这个机理机制，毕竟原以为发生这种错连的突变，蛋白2应该没表达才对。
赞一下 回复此楼
3楼2021-02-06 10:17:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
翻译蛋白，需要核糖体结合mRNA

如果没有核糖体结合位点（ribosome binding site），核糖体结合的可能性会低很多，意味着蛋白表达的可能性会低很多。

现在有很多双表达的质粒，插入MCS1和MCS2就可以同时表达两个基因。

或者只有一个RBS，但是第一个基因以TAA结尾，第二个基因以ATG开头，中间重合一个A，TAATG，核糖体在翻译完第一个基因后，距离第二个基因很近，也能把第二个基因翻译了。事实上，很多病毒基因就是这么排列的。

以上只是分析，一切还是看实验结果。你的第二个基因表达了么？
赞一下(1人) 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
2楼2021-02-06 10:03:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

很有意思的发现，如果是我，会往下做实验

（1）将78bp的序列置换成不同序列，看是否影响基因2的表达
（2）将基因2置换成其他基因，看是否也可以高效表达
（3）如果蛋白2可以纯化的话，纯化后进行N端测序，看是否是同一个其实位点
赞一下 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
4楼2021-02-06 10:29:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 334求调剂 +7 Trying] 2026-03-06 7/350 2026-03-08 03:55 by lfhuang
[考研] 08工科 +4 li李乐成 2026-03-06 4/200 2026-03-07 21:46 by 韩应许
[考研] 一志愿南京大学资源与环境专业283分求调剂 +8 追云?? 2026-03-04 8/400 2026-03-07 09:23 by 斩魂滴兔子！
[基金申请] 进入个人成果库好难，一下午都没进去 +5 mi_dilee 2026-03-05 5/250 2026-03-06 23:36 by JMS_TU
[考研] 复试调剂 +7 呼呼？~+123456 2026-03-05 10/500 2026-03-06 16:07 by @飒飒飒飒
[考研] 268求调剂 +4 刘合华 2026-03-05 4/200 2026-03-06 11:18 by lature00
[考研] 一志愿华中科技大学，化学专业344分，求调剂 +7 邢xing1 2026-03-02 7/350 2026-03-06 09:14 by guoweigw
[考研] 材料与化工304求调剂 +7 邱gl 2026-03-05 10/500 2026-03-06 01:11 by 卷柏卷柏
[考研] 301求调剂 +4 李LJR 2026-03-04 4/200 2026-03-05 13:31 by Iveryant
[考研] 一志愿东北大学080500，英一数二343分求调剂 +5 Seele_v5 2026-03-04 5/250 2026-03-05 13:26 by Iveryant
[考研] 267调剂求助 +5 聪少OZ 2026-03-04 5/250 2026-03-05 09:38 by kakakapanpan
[基金申请] 没有青基直接申请面上，感觉自己疯了 +6 kevin63t 2026-03-02 12/600 2026-03-04 22:23 by kevin63t
[考研] 320材料与化工，求调剂 +6 鹤遨予卿 2026-03-04 8/400 2026-03-04 20:47 by wutongshun
[考研] 307求调剂 +6 wyyyqx 2026-03-01 6/300 2026-03-03 09:24 by 2235787770
[考研] 271求调剂 +4 Ricardo1113 2026-03-02 4/200 2026-03-03 08:00 by 无际的草原
[考研] 化工京区271求调剂 +7 11ing 2026-03-02 7/350 2026-03-03 07:30 by 利好利好.
[考研] 【2026 硕士调剂】课题组 招收调剂生 +3 考研版棒棒 2026-03-02 5/250 2026-03-03 01:45 by kkky.
[考研] 306分材料调剂 +5 chuanzhu川烛 2026-03-01 6/300 2026-03-02 19:51 by 张晓芳0105
[基金申请] 此成果不能导入原因：元数据必填信息不完整，可 进行补充。 +4 Kittylucky 2026-03-02 5/250 2026-03-02 11:07 by jurkat.1640
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +5 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:47 by 无际的草原
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭