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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细菌表达，SDS-PAGE的一个问题。
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melodyxin

铜虫 (小有名气)

[交流] 细菌表达，SDS-PAGE的一个问题。

我用的是pET28a做载体，构建的重组质粒目的片段约1.3kb；直接取菌液做SDS-PAGE，如果得到完整翻译的话，蛋白电泳结果显示大小应该在45kd左右。

实验用未诱导的同一株菌做阴性对照，将目的菌株过夜培养，1%接种量转接2h后加IPTG诱导6h，结果在45kd附近出现了两条带，而阴性对照的没有对应的条带。

这是怎么回事？表达一个目的片段，为什么会出现两条带？

求助！！！！
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1楼 2009-07-28 20:18:42
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bio830805

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
考虑是否存在大小不一的两个亚基的情况
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不会跳舞的外语达人不是好生物学家
2楼2009-07-28 20:47:41
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-8 18:56
大小不一的两个亚基?您是说同分异构体吗？
那会对蛋白活力有影响么？
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3楼2009-07-28 21:38:58
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w19840308

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
跑了几次电泳？结果都是这样？
确定是单克隆？
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4楼2009-07-28 21:49:13
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
随机挑了四个单克隆都是一样的结果。跑了一次电泳。
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5楼2009-07-28 21:55:45
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
有人可以帮忙分析看看吗？我的目的片段GC含量偏高，大概在63%左右，是不是对细菌表达有影响？
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6楼2009-07-29 00:38:02
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蓝皮鼠7983

至尊木虫 (文坛精英)

飞过蓝天
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
GC含量高说明能量大,需要另外设计思路
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海到尽头天做岸，山登绝顶我为峰。
7楼2009-07-29 00:59:54
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-2 13:04
表达蛋白出现部分降解，就成了大小不等的两个条带了。建议表达时分时间段取样，注意保存条件，降低表达时的温度。然后跑电泳看不同时间段表达产物的大小，条带。
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金币是赌出来的
8楼2009-07-29 08:42:14
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-2 13:04
是不是表达时间太久的缘故？那是不是说，必须在蛋白没有降解以前测定酶活了？
一般隔多久取样，温度我是定在30度诱导的，还要再降低吗？
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9楼2009-08-02 12:02:37
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melodyxin

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 蓝皮鼠7983 at 2009-7-29 00:59:
GC含量高说明能量大,需要另外设计思路

什么意思？不是很明白啊。您是说要换载体换宿主吗？
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10楼2009-08-02 12:03:37
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