细菌表达，SDS-PAGE的一个问题。 - 生物科学 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2009-08-02 12:42:42

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melodyxin

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-8-2 12:42:
有可能是蛋白被修饰，或者部分蛋白没有表达标签
过柱纯一次然后做个western验证下

哦，谢谢。。。可是我们实验的关键是为了让蛋白表达有酶活；而且实验室也没有柱没有western之类的相关仪器材料。因为老板给的任务重点不是这个。。。
Sigh

12楼2009-08-02 19:53:38

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wjswj

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每隔半小时取一次样品就可以。表达温度当然可以进一步降低，以前我都做过18度诱导的。表达出来的蛋白不稳定也是正常现象。

金币是赌出来的

13楼2009-08-03 09:10:32

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melodyxin

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Originally posted by wjswj at 2009-8-3 09:10:
每隔半小时取一次样品就可以。表达温度当然可以进一步降低，以前我都做过18度诱导的。表达出来的蛋白不稳定也是正常现象。

啊，好的，多谢了！再请教哦，如果我想要得到蛋白的酶活表达，是不是意味着必须先摸清楚SDS-PAGE的实验条件，确定在什么条件下蛋白能够不降解，并且稳定表达，然后再去测定酶活？

14楼2009-08-03 23:34:00

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liubang8355

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拿你表达产物测定活性,可能是蛋白的亚基大小不一样

15楼2009-08-04 00:12:20

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HarveyWang

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离得很近的两条蛋白可能就相差2-6个氨基酸，
这很可能是翻译过程除了问题，

我也碰到过类似的问题，只能是换质粒重新构建了。

【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】

16楼2009-08-04 08:05:54

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HarveyWang

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Originally posted by melodyxin at 2009-8-3 23:34:

啊，好的，多谢了！再请教哦，如果我想要得到蛋白的酶活表达，是不是意味着必须先摸清楚SDS-PAGE的实验条件，确定在什么条件下蛋白能够不降解，并且稳定表达，然后再去测定酶活？

不是SDS-PAGE的问题啊，是你本身表达的蛋白出了问题，两种蛋白很可能都会有活性，但相差几个氨基酸。

【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】

17楼2009-08-04 08:07:22

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baiyidao

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这段基因中包含两个开放阅读框，测测酶活试试，又没货就不要管它了

18楼2009-08-04 16:39:24

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melodyxin

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Originally posted by HarveyWang at 2009-8-4 08:05:
离得很近的两条蛋白可能就相差2-6个氨基酸，
这很可能是翻译过程除了问题，

我也碰到过类似的问题，只能是换质粒重新构建了。

啊？？为什么啊？？pET28a也会有问题？？？

19楼2009-08-05 21:38:11

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银杏下

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很可能是c端含有连续的稀有密码子，使蛋白不能完全被翻译。我个人认为与GC含量无关。可以尝试用Rosetta表达。