| 查看: 1175 | 回复: 3 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者rui93614将赠送您 66 个金币 | ||
rui93614新虫 (小有名气)
|
[求助]
CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教 已有1人参与
|
|
|
CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教 本人就读于中山大学一年级博士，做了半年的基因敲除工作。第一次选用的标准菌株自身存在太多种质粒，导致电击质粒会出现一个细菌的自身保护的排斥反应，导致质粒电不进去。第二次选了不含有任何质粒的标准菌株，首先我把pCasAb质粒（我叫它第一质粒，包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达）电转进细菌，然后进行抗性筛选和PCR鉴定。筛选转化成功的菌株制备电转化感受态（添加IPTG以诱导RecAb重组酶和Cas9核酸酶表达），然后把构建好的第二质粒pCasAb质粒（包含可表达sgRNA的启动子；spacer：用于插入约20bp的靶点序列；抗性基因片段；sacB基因：用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因等）和80bp长度的修复模板DNA共同电转进上述感受态。然后涂布于双抗板上。看文献说这种方法成功率很高的，最后在双抗板上长出的单菌落很多，经过PCR验证并没有敲除成功，凝胶电泳条带与野生型一致。我就不知道问题出在哪里了，恳请大神们给予指导，不胜感谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
0817化学工程319求调剂
已经有7人回复
-
083000环境科学与工程调剂
已经有5人回复
-
求调剂 一志愿苏州大学，0856化工323分 | 本科应化 | 有专利/竞赛/科研助手经历 |
已经有8人回复
-
0856材料与化工353分求调剂
已经有5人回复
-
282分材料专业求调剂院校
已经有15人回复
-
化工284求调剂
已经有12人回复
-
288求调剂
已经有13人回复
-
一志愿安徽大学材料工程专硕313分，求调剂的学校
已经有3人回复
-
考研一志愿长安大学材料与化工309分请求调剂
已经有8人回复
-
085600材料与化工 326 求调剂
已经有4人回复
forhighbio 
捐助贵宾 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 825.8
- 散金: 100
- 红花: 20
- 帖子: 1200
- 在线: 20.3小时
- 虫号: 15753792
- 注册: 2019-07-28
- 专业: 微生物学
2楼2020-07-30 08:56:28
3楼2021-06-10 11:55:57
4楼2021-06-10 11:57:42
