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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教
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rui93614

新虫 (小有名气)

[求助] CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教 已有1人参与

CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教
本人就读于中山大学一年级博士，做了半年的基因敲除工作。第一次选用的标准菌株自身存在太多种质粒，导致电击质粒会出现一个细菌的自身保护的排斥反应，导致质粒电不进去。第二次选了不含有任何质粒的标准菌株，首先我把pCasAb质粒（我叫它第一质粒，包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段，tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达）电转进细菌，然后进行抗性筛选和PCR鉴定。筛选转化成功的菌株制备电转化感受态（添加IPTG以诱导RecAb重组酶和Cas9核酸酶表达），然后把构建好的第二质粒pCasAb质粒（包含可表达sgRNA的启动子；spacer：用于插入约20bp的靶点序列；抗性基因片段；sacB基因：用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因等）和80bp长度的修复模板DNA共同电转进上述感受态。然后涂布于双抗板上。看文献说这种方法成功率很高的，最后在双抗板上长出的单菌落很多，经过PCR验证并没有敲除成功，凝胶电泳条带与野生型一致。我就不知道问题出在哪里了，恳请大神们给予指导，不胜感谢。
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1楼 2020-07-29 18:12:18
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
tac启动子不一定能够正常启动。

发自小木虫Android客户端
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2楼2020-07-30 08:56:28
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pjf66666

新虫 (初入文坛)
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3楼2021-06-10 11:55:57
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pjf66666

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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4楼2021-06-10 11:57:42
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