24小时热门版块排行榜    

查看: 684  |  回复: 3
【悬赏金币】回答本帖问题,作者rui93614将赠送您 66 个金币

rui93614

新虫 (小有名气)

[求助] CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教已有1人参与

CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教
本人就读于中山大学一年级博士,做了半年的基因敲除工作。第一次选用的标准菌株自身存在太多种质粒,导致电击质粒会出现一个细菌的自身保护的排斥反应,导致质粒电不进去。第二次选了不含有任何质粒的标准菌株,首先我把pCasAb质粒(我叫它第一质粒,包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段,tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达)电转进细菌,然后进行抗性筛选和PCR鉴定。筛选转化成功的菌株制备电转化感受态(添加IPTG以诱导RecAb重组酶和Cas9核酸酶表达),然后把构建好的第二质粒pCasAb质粒(包含可表达sgRNA的启动子;spacer:用于插入约20bp的靶点序列;抗性基因片段;sacB基因:用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因等)和80bp长度的修复模板DNA共同电转进上述感受态。然后涂布于双抗板上。看文献说这种方法成功率很高的,最后在双抗板上长出的单菌落很多,经过PCR验证并没有敲除成功,凝胶电泳条带与野生型一致。我就不知道问题出在哪里了,恳请大神们给予指导,不胜感谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)


tac启动子不一定能够正常启动。

发自小木虫Android客户端
2楼2020-07-30 08:56:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pjf66666

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by forhighbio at 2020-07-30 08:56:28
tac启动子不一定能够正常启动。

我也做过,不可能达到论文中的效率,可以多挑选克隆,100个,也许有阳性,欢迎交流。qq 182389642
3楼2021-06-10 11:55:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pjf66666

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也做过这个实验,同样的质粒,但是明显达不到论文中的效率,挑选100个克隆,可能有阳性。欢迎交流:QQ 182389642
4楼2021-06-10 11:57:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 rui93614 的主题更新
不应助 确定回帖应助 (注意:应助才可能被奖励,但不允许灌水,必须填写15个字符以上)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 夏至,要不要硕博联谊 +4 我是王小帅 2024-06-21 6/300 2024-06-25 14:25 by 庭前花开月儿明
[基金申请] 博后面上今天下午会公布吗?大家有无消息? +9 地理学1995 2024-06-24 12/600 2024-06-25 14:09 by guoguo0119
[基金申请] 专科院校申请国自然 +12 孤单12站 2024-06-24 17/850 2024-06-25 13:14 by wangting_nju
[教师之家] 复旦夏同学退学理由说明,哪儿可以下载? +7 苏东坡二世 2024-06-21 8/400 2024-06-25 12:42 by 药嘿1233
[基金申请] 演员杨幂在核心期刊发表论文,中国广播电视学期刊 +9 babu2015 2024-06-22 12/600 2024-06-25 11:05 by 我是勇敢牛牛
[基金申请] 焦虑没有毛线用,默默前行是王道! +4 漠上藜梭 2024-06-24 5/250 2024-06-25 10:20 by xli1984
[基金申请] 2024安徽省哲社立项名单公示 +3 robin_work 2024-06-24 5/250 2024-06-25 09:58 by robin_work
[基金申请] 今年什么时候会评啊 +7 lancet0903 2024-06-24 7/350 2024-06-24 18:48 by Pickfoot
[金属] EBSD的解析率只有10% +3 wallace6666 2024-06-20 7/350 2024-06-24 16:52 by wallace6666
[金属] 寻找钛合金热压缩代做 +4 liuyang358 2024-06-23 4/200 2024-06-24 13:50 by 搬砖狗不放弃
[基金申请] 能看出是否上会了吗 +9 articlefan 2024-06-23 11/550 2024-06-24 11:20 by articlefan
[基金申请] 博后面上和特助今天出吗? +41 逗您玩 2024-06-21 77/3850 2024-06-24 09:47 by weichuny
[基金申请] 请问三个字的中文名字,在文中到底怎么表示? 5+3 zhongyuan764 2024-06-22 6/300 2024-06-23 17:42 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 工材口青年基金上会可能性 +10 今晚推荐22 2024-06-19 13/650 2024-06-23 15:11 by Pickfoot
[基金申请] 工材口青年基金大概什么样能上会? +15 今晚推荐22 2024-06-20 21/1050 2024-06-22 23:04 by qbn0326
[基金申请] 教育部基金 +5 m1393 2024-06-21 5/250 2024-06-21 21:13 by odes
[论文投稿] ACS 编辑的意见 10+3 哈哈妞1993 2024-06-20 3/150 2024-06-21 17:06 by 投个论文
[有机交流] 怎么萃取出锡盐内包裹的化合物 +4 硕六过 2024-06-19 5/250 2024-06-21 09:50 by 光超嘟嘟
[论文投稿] ACS AMI 返回审稿意见,一个大修,两个据稿,编辑给的修改重投 +7 智商已更新 2024-06-19 7/350 2024-06-20 19:54 by kinlin13
[基金申请] 基金得中 +4 woaini0218 2024-06-18 4/200 2024-06-19 17:27 by mengzl
信息提示
请填处理意见