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rui93614

新虫 (小有名气)

[求助] CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教已有1人参与

CRSPR Cas9技术做细菌的基因敲除相关问题请教
本人就读于中山大学一年级博士,做了半年的基因敲除工作。第一次选用的标准菌株自身存在太多种质粒,导致电击质粒会出现一个细菌的自身保护的排斥反应,导致质粒电不进去。第二次选了不含有任何质粒的标准菌株,首先我把pCasAb质粒(我叫它第一质粒,包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重组酶系统基因片段、tac promoter启动子片段,tac promoter启动子调控RecAb重组酶系统和Cas9蛋白基因的表达)电转进细菌,然后进行抗性筛选和PCR鉴定。筛选转化成功的菌株制备电转化感受态(添加IPTG以诱导RecAb重组酶和Cas9核酸酶表达),然后把构建好的第二质粒pCasAb质粒(包含可表达sgRNA的启动子;spacer:用于插入约20bp的靶点序列;抗性基因片段;sacB基因:用于后续质粒消除的蔗糖敏感基因等)和80bp长度的修复模板DNA共同电转进上述感受态。然后涂布于双抗板上。看文献说这种方法成功率很高的,最后在双抗板上长出的单菌落很多,经过PCR验证并没有敲除成功,凝胶电泳条带与野生型一致。我就不知道问题出在哪里了,恳请大神们给予指导,不胜感谢。
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forhighbio

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tac启动子不一定能够正常启动。

发自小木虫Android客户端
2楼2020-07-30 08:56:28
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pjf66666

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by forhighbio at 2020-07-30 08:56:28
tac启动子不一定能够正常启动。

我也做过,不可能达到论文中的效率,可以多挑选克隆,100个,也许有阳性,欢迎交流。qq 182389642
3楼2021-06-10 11:55:57
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pjf66666

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也做过这个实验,同样的质粒,但是明显达不到论文中的效率,挑选100个克隆,可能有阳性。欢迎交流:QQ 182389642
4楼2021-06-10 11:57:42
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