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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)

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[交流] 蛋白诱导表达已有4人参与

蛋白上清一直没有表达，换了各种条件，还是不行

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1楼 2020-07-29 09:53:25

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apple870502

木虫 (小有名气)

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你的问题表达不清，无法确认你是否真的“换了各种条件”，几个建议：
1、请确认你是否可以成功诱导该蛋白的表达？全菌液中是否有相应条带？
如确认可表达，需要做几个尝试，总之目的是让蛋白表达够慢，这样才不至于因表达过快而进入包涵体：
1、降低诱导温度，可16度过夜表达；
2、降低IPTG浓度，减半或减至更少，如降一个数量级；
3、若以上都试过不行，换表达菌株；
4、若表达菌株也换过不行，只能换载体了，这样就等于重头开始，比较麻烦；
5、如果实在从上清中得不到，也不想换载体重头开始，可以尝试从包涵体中纯化目的蛋白。

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2楼2020-07-29 11:32:48

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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

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除了楼上说的，你的蛋白是从什么物种来的，要在什么物种里面表达，是否经过密码子优化？

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3楼2020-07-29 13:04:44

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眼泪成诗

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3楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-07-29 13:04:44
除了楼上说的，你的蛋白是从什么物种来的，要在什么物种里面表达，是否经过密码子优化？

都是原核,农杆菌和大肠杆菌

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4楼2020-07-31 10:40:01

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眼泪成诗

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引用回帖:

2楼: Originally posted by apple870502 at 2020-07-29 11:32:48
你的问题表达不清，无法确认你是否真的“换了各种条件”，几个建议：
1、请确认你是否可以成功诱导该蛋白的表达？全菌液中是否有相应条带？
如确认可表达，需要做几个尝试，总之目的是让蛋白表达够慢，这样才不至 ...

载体尝试过pet-32a和28a，也16度诱导过.iptg浓度最低尝试过0.01mM，还是不行

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5楼2020-07-31 10:42:34

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