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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白诱导表达 已有4人参与

蛋白上清一直没有表达，换了各种条件，还是不行

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1楼 2020-07-29 09:53:25
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apple870502

木虫 (小有名气)
★
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你的问题表达不清，无法确认你是否真的“换了各种条件”，几个建议：
1、请确认你是否可以成功诱导该蛋白的表达？全菌液中是否有相应条带？
如确认可表达，需要做几个尝试，总之目的是让蛋白表达够慢，这样才不至于因表达过快而进入包涵体：
1、降低诱导温度，可16度过夜表达；
2、降低IPTG浓度，减半或减至更少，如降一个数量级；
3、若以上都试过不行，换表达菌株；
4、若表达菌株也换过不行，只能换载体了，这样就等于重头开始，比较麻烦；
5、如果实在从上清中得不到，也不想换载体重头开始，可以尝试从包涵体中纯化目的蛋白。
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2楼2020-07-29 11:32:48
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
除了楼上说的，你的蛋白是从什么物种来的，要在什么物种里面表达，是否经过密码子优化？
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3楼2020-07-29 13:04:44
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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-07-29 13:04:44
除了楼上说的，你的蛋白是从什么物种来的，要在什么物种里面表达，是否经过密码子优化？

都是原核,农杆菌和大肠杆菌

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4楼2020-07-31 10:40:01
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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by apple870502 at 2020-07-29 11:32:48
你的问题表达不清，无法确认你是否真的“换了各种条件”，几个建议：
1、请确认你是否可以成功诱导该蛋白的表达？全菌液中是否有相应条带？
如确认可表达，需要做几个尝试，总之目的是让蛋白表达够慢，这样才不至 ...

载体尝试过pet-32a和28a，也16度诱导过.iptg浓度最低尝试过0.01mM，还是不行

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5楼2020-07-31 10:42:34
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考研行

禁虫 (小有名气)
★
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6楼2020-07-31 12:52:55
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
★
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建议你查一下类似蛋白的相关文献，看下他们的表达条件。我之前表达一个细胞色素家族的蛋白，就需要辅助质粒才能表达。
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7楼2020-07-31 13:22:06
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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-07-31 13:22:06
建议你查一下类似蛋白的相关文献，看下他们的表达条件。我之前表达一个细胞色素家族的蛋白，就需要辅助质粒才能表达。

我也查了一些，有的文章用的载体不太一样，其他条件都差不多，我再多查查吧

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8楼2020-07-31 15:19:56
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眼泪成诗

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 考研行 at 2020-07-31 12:52:55
看看是不是移码了，设计引物的时候要注意移码。或者换个表达菌比如rosseta试试看

移码这些我也有注意，我换宿主菌试一下吧

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9楼2020-07-31 15:21:16
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