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stella0xhx

新虫 (小有名气)

[交流] 菌体拉PCR后电泳一片模糊

用菌体做PCR的模板,总是无目标条带,常常电泳是一片拖带现象,请教各位这是什么原因啊?
另外,用菌体做模板拉PCR时,应该注意些什么啊?怎样才能拉出我想要的大小片段呢?请各位高手赐教啊!!
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stella0xhx

新虫 (小有名气)

我是用菌液做的PCR,基因在总DNA上,我是想p出大概正确的基因,然后连puc118后做质粒,测序。可是p不出条带来,我也不知道哪个菌落中有我想要的条带,不想提总DNA后再p,所以直接用菌液试,试了百来个菌落了,没结果,有点浪费,也不知道有什么更好的方法筛选我要的菌了
5楼2009-07-15 22:53:41
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muyuan

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果是菌液的话,25ul体系加1ul就够了,加多了不好
2楼2009-07-15 21:32:07
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icespring1983

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你说的是菌体PCR鉴定是否插入目的片段吗?
其实和正常的PCR一样,用菌体还不如用菌液PCR,虽然这两种PCR假阳性据说较多(当我们实验室一般p出来的就是插入目的片段了),就是直接挑单克隆培养,37度培养几个小时吧(我一般9-10h,过夜也可以)然后取1微培养液做模板就可以,其他条件和扩增基因是一样。电泳出现模糊我个人觉得就是非特异扩增,可能由于菌体作为模板使得模板量太大。
3楼2009-07-15 21:36:13
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yanlili

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你是要从菌的DNA上扩个基因出来还是要做鉴定啊
拖尾可能是你的引物特异性不好
要注意以下几点(个人经验)
1.预变性94度要延长至10min
2.pcr产物不要点的太多,3微升差不多,因为有次我点太多导致电泳结果是全部的拖尾,减少上样量后就好了
3.看你的基因在质粒还是在总DNA上,提DNA再做pcr,调节退火温度,提高特异性
4楼2009-07-15 22:07:54
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