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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 菌体拉ＰＣＲ后电泳一片模糊
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stella0xhx

新虫 (小有名气)

[交流] 菌体拉ＰＣＲ后电泳一片模糊

用菌体做ＰＣＲ的模板，总是无目标条带，常常电泳是一片拖带现象，请教各位这是什么原因啊？
另外，用菌体做模板拉ＰＣＲ时，应该注意些什么啊？怎样才能拉出我想要的大小片段呢？请各位高手赐教啊！！
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1楼 2009-07-15 21:17:53
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muyuan

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果是菌液的话，25ul体系加1ul就够了，加多了不好
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2楼2009-07-15 21:32:07
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icespring1983

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你说的是菌体PCR鉴定是否插入目的片段吗？
其实和正常的PCR一样，用菌体还不如用菌液PCR，虽然这两种PCR假阳性据说较多（当我们实验室一般p出来的就是插入目的片段了），就是直接挑单克隆培养，37度培养几个小时吧（我一般9-10h，过夜也可以）然后取1微培养液做模板就可以，其他条件和扩增基因是一样。电泳出现模糊我个人觉得就是非特异扩增，可能由于菌体作为模板使得模板量太大。
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3楼2009-07-15 21:36:13
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yanlili

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你是要从菌的DNA上扩个基因出来还是要做鉴定啊
拖尾可能是你的引物特异性不好
要注意以下几点（个人经验）
1.预变性94度要延长至10min
2.pcr产物不要点的太多，3微升差不多，因为有次我点太多导致电泳结果是全部的拖尾，减少上样量后就好了
3.看你的基因在质粒还是在总DNA上，提DNA再做pcr，调节退火温度，提高特异性
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4楼2009-07-15 22:07:54
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stella0xhx

新虫 (小有名气)
我是用菌液做的PCR，基因在总DNA上，我是想p出大概正确的基因，然后连puc118后做质粒，测序。可是p不出条带来，我也不知道哪个菌落中有我想要的条带，不想提总DNA后再p，所以直接用菌液试，试了百来个菌落了，没结果，有点浪费，也不知道有什么更好的方法筛选我要的菌了
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5楼2009-07-15 22:53:41
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stella0xhx

新虫 (小有名气)
我用的是目的基因的保守序列设计的引物，想筛选未知菌落中的目的菌、
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6楼2009-07-15 22:56:02
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小小木虫8580

金虫 (小有名气)
引物特异性不好
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7楼2009-07-15 22:58:28
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liby

铜虫 (初入文坛)
想想别的法筛吧，直接P肯定不好做
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8楼2009-07-16 17:22:58
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