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381466632木虫 (正式写手)
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制备抗体的western blot 验证问题
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我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。 采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？ [ Last edited by 381466632 on 2009-7-20 at 08:57 ] |
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2楼2009-07-16 10:21:59
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我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。 采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？  |
6楼2009-07-17 17:29:52
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