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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 制备抗体的western blot 验证问题
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381466632

木虫 (正式写手)

[交流] 制备抗体的western blot 验证问题

我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。
采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？

[ Last edited by 381466632 on 2009-7-20 at 08:57 ]
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1楼 2009-07-15 19:14:32
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匿名

用户注销 (小有名气)
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2楼2009-07-16 10:21:59
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poog502

木虫 (正式写手)
不懂，学习一下
下面的高手接着回答
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3楼2009-07-16 11:02:22
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antibody01

金虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-18 18:48
就你目前提供的资料来看,你的实验设计失败.表达的目的蛋白分子量(11KD)小于GST分子量(26kd),免疫时产生的抗体绝大部分是针对GST蛋白的而不是针对你的目的蛋白的甚至不会产生针对你的目标蛋白的抗体.这就是为什么在细菌蛋白上有目的条带而在组织蛋白上没有的原因。
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生活就像强奸，无法反抗就要学会享受； 工作就像轮奸，你不行就要别人上； 社会就像自慰，一切都要靠自己的双手解决。
4楼2009-07-16 13:12:38
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-18 18:48
楼主说得很不清楚
原核表达有蛋白（蛋白胶检验的吧），怎么还要提组织蛋白?  
到底是原核表达 还是真核表达，怎么提了细菌蛋白，还提组织蛋白？
1：10都没抗体 基本没戏 高滴度1：10000的血清都能做
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
5楼2009-07-16 13:39:46
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381466632

木虫 (正式写手)
amisking(金币+0,VIP+0):同情一下！可以吧这楼的内容编辑到一楼！ 7-18 18:48
我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。
采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？
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6楼2009-07-17 17:29:52
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381466632

木虫 (正式写手)
怎么没人回我
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7楼2009-07-18 17:56:57
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galin

金虫 (小有名气)
★
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你用来提取组织蛋白的缓冲液是什么？有没有加蛋白酶抑制剂？可以用TBS，加少许pmsf。如果你的抗血清没有纯化的话，我觉得可以用1：100试试
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他年破壁飞腾去，驱遣风雷不怪渠
8楼2009-07-18 18:45:32
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381466632

木虫 (正式写手)
提蛋白用组织裂解液，加了蛋白酶抑制剂1:100,1:100试过了。没有出来。
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9楼2009-07-18 22:35:30
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houjinglhy

荣誉版主 (文坛精英)

表达自由，人权之基。

优秀版主
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按你所说，抗体肯定没问题了。
问题出在你的蛋白抽提过程，或者组织表达蛋白太少，或者压根就没蛋白在你组织里表达。
首先，你别再做什么抗体稀释梯度了 用1：1000就可以了
其次，建议你想办法浓缩下组织提取的蛋白（分泌表达的话可以用TCA浓缩，胞内的话，不清楚怎么浓缩好）
每次做WB用菌体蛋白做阳性对照，避免WB操作带来的影响。
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
10楼2009-07-18 23:10:18
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