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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【交流/求助】请教蛋白纯化问题
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高丹

新虫 (初入文坛)

[交流] 【交流/求助】请教蛋白纯化问题

请教蛋白纯化问题，十分感谢！
    本人目前在纯化一个蛋白，很苦恼。通过氨基酸预测该蛋白的等电点为4.47，一些参考文献上介绍该蛋白的等电点是4左右。自己小试了一下，在PH4.2，4.4 buffer 中目的蛋白确实在沉淀中。因此我用DEAE阴离子交换柱纯化目的蛋白，但是奇怪的是PH在6，7，8都不能很好的吸附在柱上（PH6，7 蛋白体系是10mM PB，PH8 蛋白体系是20mM TRIS。HCL），流穿很多。PH5的时候流穿很少，以为是吸到柱子上了呢，结果洗脱没有该蛋白i，将胶挖出来一些胶蛋白电泳也没看到目的条带。我现在就搞不懂了，PH5的条件下，蛋白哪去了？为什么PI那么低，在PH6，7，8不能吸附？

[ Last edited by amisking on 2009-12-30 at 21:43 ]
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1楼 2009-07-14 10:33:54
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wql1828

木虫 (小有名气)

helix
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你重复过吗？   会不会是deae的问题？  还有你做了确定洗脱液的ph实验吗?  一般情况确定后再加1个ph！
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2楼2009-07-14 11:50:33
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
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我的pI是9.14，但是在pH7的时候还是挂不到阳离子柱上。
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3楼2009-07-14 12:52:03
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高丹

新虫 (初入文坛)
重复过一次，两次DEAE胶不同。PH5.0 时洗脱液PH也是5.0 里面有1M nacl, 您说的再加一个PH是6.0洗脱吗？还是什么意思？
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4楼2009-07-14 13:54:02
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wql1828

木虫 (小有名气)

helix
★
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是   你用ph6.0的洗脱液试一试  ！！！     我的意思是确定你的目的蛋白能被静电作用吸附时的ph   然后再加一个ph  作为洗脱缓冲液！！  原因是这样洗脱效果会更好！！！  如果ph过高会洗不下来的   

     还有可能有些特殊蛋白对阴离子交换柱无反应     可以换阳离子交换柱纯试一试  但是前提保证你的目的蛋白有活性不变性
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5楼2009-07-14 15:19:33
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aaaaaa1380

至尊木虫 (知名作家)
????
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6楼2009-07-14 16:59:19
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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7楼2009-07-14 18:21:43
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w19840308

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
ph5时是不是因为你挖出来很少的胶，造成假阴性的结果，你本身的蛋白加样量是多少计算过么？
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8楼2009-07-14 20:46:56
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简约豆豆

金虫 (小有名气)

离子柱

★
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引用回帖:
Originally posted by aaaaaa1380 at 2009-7-14 16:59:
学习学习

请问，具体是怎么用EP管测试不同Ph的结合能力的？另外EP管是什么管啊？
我做的是分离纯化一种小肽，也是不知道等电点，所以在选择离子柱的时候不知道怎么选择，看到你的帖子，就特别想知道，你说的方法是怎么操作的？
谢谢!
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9楼2009-12-30 21:33:23
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简约豆豆

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by enclve at 2009-7-14 18:21:
1.都有文献了，没给个经典的步骤么？
2.不要去预测，没有用，，有很多蛋白质电荷分布特别不均匀，在离子交换的方法时候都是部分结合，部分流出。
3.你愿意的话，用半天时间在EP管中测试不同pH的结合能力，然后跑 ...

请问，具体是怎么用EP管测试不同Ph的结合能力的？另外EP管是什么管啊？
我做的是分离纯化一种小肽，也是不知道等电点，所以在选择离子柱的时候不知道怎么选择，看到你的帖子，就特别想知道，你说的方法是怎么操作的？
谢谢!
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10楼2009-12-30 21:34:55
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