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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教Western Blot有关问题
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2008314

[交流] 请教Western Blot有关问题

各位虫友：

我最近在做Western Blot，其中有些问题不太明白，希望做过这个的指教一下：

1） 浓缩胶起什么作用？

2） 转膜时，滤纸起什么作用，是不是必须要用特定的滤纸，一般定性或定量用来过滤的滤纸行不行？

3） 32KD的蛋白湿转需要用多大电流和多长的时间？

[ Last edited by 2008314 on 2009-7-14 at 09:46 ]
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1楼 2009-07-14 08:50:28
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antibody01

金虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
350784478(金币+1,VIP+0):感谢回帖 7-14 09:42
2008314(金币+3,VIP+0):谢谢交流，不过第三个问题还没回答 7-14 09:49
1)浓缩蛋白样品
2)保持胶与膜的密切接触，避免气泡。普通滤纸就行。
3)我们采用半干转，浓缩胶80V，分离胶120V.时间需要参考Marker位置。
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生活就像强奸，无法反抗就要学会享受； 工作就像轮奸，你不行就要别人上； 社会就像自慰，一切都要靠自己的双手解决。
2楼2009-07-14 09:06:13
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zhaolixia0814

金虫 (小有名气)
32KD的蛋白湿转需要用多大电流和多长的时间？

100kD以下的蛋白半干转效果比较好.  100mA，半个多小时左右吧。一般来讲，0.8-3.0mA/CM2
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3楼2009-07-14 10:14:00
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
2008314(金币+1,VIP+0):3Q 7-14 15:44
不一定每个实验室都有半干转的仪器
考虑到转内参（32KD一般用50KD的tublin做内参吧），可以用恒压100V冰上转1h，这样绝对转过去了。
室温转可以试试30~40min
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4楼2009-07-14 10:20:11
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baisuilan

金虫 (正式写手)
３２ｋｄ湿转，我们用２００ｍＡ一个半小时，或者１８０ｍＡ三小时。肯定没问题。
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5楼2009-07-14 12:29:43
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.
★
2008314(金币+1,VIP+0):谢谢 7-14 15:43
湿转，32KD的蛋白质90V，电流0.12-0.18A，时间80分钟，还要看你的膜是那个公司的。一般我们转70多KD的蛋白转120分钟。
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多点思维，多点idea
6楼2009-07-14 15:19:06
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