| 查看: 5937 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
【求助】ChIP超声效果检验的解交联问题/DNA弥散片段集中于5000bp
|
||
|
大家好，刚接触ChIP，遇到了比较疑惑的（猜测可能是）解交联的问题，希望大家能给予指导，先说声谢谢！ 年前预实验交联（1%甲醛，5-10min）、超声（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交联消化（65度0.25M Nacl振摇过夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、纯化DNA，有得到我们认为比较好的电泳结果，如图1所示。 【问题来了！  】正打算进一步确定最佳的交联时间和超声数的时候，出现了图2的电泳结果（DNA不弥散了集中在5000bp，感觉是基因组DNA的位置）。于是陆续更换了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，还参考论坛上的解交联条件变化了一下解交联和消化的顺序……换了新买的蛋白酶K之后，胶图终于有了一点变化，但主条带还是没有下来：请看图2。 旧样品里的H-25是第一张图的#7(之前解交联电泳结果不错的，取了-80冻的超声样品重新解交联），考虑到①H-25这个结果； ②25/30 cycle已经是一个比较长的超声时间了，12.5/15min，和文献中的也差不多； ③超声循环数的增加并没有使DNA条带发生一点点下移； ④lab另一位同学也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和国产的超声仪器（不记得型号了），其他试剂（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，顺利得到了理想的片段化基因。 所以我们更偏向认为是超声之后的步骤发生问题，但试剂基本换过了，实在排除不出原因。只好来论坛求助，有没有做过chip的大神能看出哪里出问题呢…… 补充： 1.buffer配方：因为想要IP的是转录因子，所以当时和师兄参考了文献之后，决定自己配制比较温和的buffer（一直放在4度，使用前现加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交联条件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 静置过夜，酚氯仿异戊醇纯化DNA。上图最右测是分别不加蛋白酶K、不解交联、不加RNAse想看有啥影响，发现好像没啥影响，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。。总不会是蛋白酶K把DNA锁在那了吧，可DNA纯化应该也去掉了啊。。 3.之所以更改解交联的流程，一方面参考了其他人的步骤，另一方面是因为自己原本的protocol（65度0.25M Nacl振摇过夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度过夜之后会出现小白片、片状沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前预实验的时候没有注意是否有这个现象，问了其他人没有这个高温析出蛋白的情况；不知道是否预示着哪里出了问题？ 4.比对了buffer的成分，其实和常用的也挺像，感觉就是浓度低一些，按理说放四度不会有啥变化啊，可也没有别的东西能怀疑了。有没有朋友可以支支招？ 大家有任何建议或提示都请评论，我先谢为敬！！！ |
回复此楼» 本帖附件资源列表
-
欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 1.png
- 附件 2 : 2.png
- 附件 3 : 3.png
2020-05-30 02:46:58, 232.99 K
2020-05-30 02:46:59, 190.79 K
2020-05-30 02:46:59, 265.6 K
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有54人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
5楼2020-06-02 00:57:04
0o向日葵o0
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1999.1
- 散金: 50
- 红花: 2
- 沙发: 2
- 帖子: 913
- 在线: 156.9小时
- 虫号: 2369477
- 注册: 2013-03-22
- 专业: 植物病理学
2楼2020-05-30 09:32:51
3楼2020-05-30 11:38:58
|
猜测，转录因子是属于瞬时转染，同一批样品一个先做一个后做，交联和破碎的时间可能就需要重新摸索下，我们前面做就出现过这样情况，先摸索出的条件在做同一批低温保存了的样品就不行 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2020-06-01 17:06:37
