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[求助]
【求助】ChIP超声效果检验的解交联问题/DNA弥散片段集中于5000bp
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大家好，刚接触ChIP，遇到了比较疑惑的（猜测可能是）解交联的问题，希望大家能给予指导，先说声谢谢！ 年前预实验交联（1%甲醛，5-10min）、超声（bioruptor plus-high-30s on/off-薄壁管）、解交联消化（65度0.25M Nacl振摇过夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）、纯化DNA，有得到我们认为比较好的电泳结果，如图1所示。 【问题来了！  】正打算进一步确定最佳的交联时间和超声数的时候，出现了图2的电泳结果（DNA不弥散了集中在5000bp，感觉是基因组DNA的位置）。于是陆续更换了甲醛、Nacl、蛋白酶K、RNAse，还参考论坛上的解交联条件变化了一下解交联和消化的顺序……换了新买的蛋白酶K之后，胶图终于有了一点变化，但主条带还是没有下来：请看图2。 旧样品里的H-25是第一张图的#7(之前解交联电泳结果不错的，取了-80冻的超声样品重新解交联），考虑到①H-25这个结果； ②25/30 cycle已经是一个比较长的超声时间了，12.5/15min，和文献中的也差不多； ③超声循环数的增加并没有使DNA条带发生一点点下移； ④lab另一位同学也做chip，他ip的不是TF所以直接用了SDS lysis buffer（1%SDS，我的sonication buffer里的SDS是0.1%）和国产的超声仪器（不记得型号了），其他试剂（甲醛、甘氨酸、Nacl、RNAse、蛋白酶K）都用的我的，顺利得到了理想的片段化基因。 所以我们更偏向认为是超声之后的步骤发生问题，但试剂基本换过了，实在排除不出原因。只好来论坛求助，有没有做过chip的大神能看出哪里出问题呢…… 补充： 1.buffer配方：因为想要IP的是转录因子，所以当时和师兄参考了文献之后，决定自己配制比较温和的buffer（一直放在4度，使用前现加cocktail），配方如下： lysis buffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, protease inhibitors) lysis buffer II (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mMEDTA, 0.5 mM EGTA, protease inhibitors) sonication buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, and 1% Triton X-100, protease inhibitors) 2.目前的解交联条件是：37 ℃ RNAse 1h，65 ℃ 0.2mM Nacl+蛋白酶K 静置过夜，酚氯仿异戊醇纯化DNA。上图最右测是分别不加蛋白酶K、不解交联、不加RNAse想看有啥影响，发现好像没啥影响，更疑惑了……更迷的是，不加蛋白酶K的效果反而更好。。总不会是蛋白酶K把DNA锁在那了吧，可DNA纯化应该也去掉了啊。。 3.之所以更改解交联的流程，一方面参考了其他人的步骤，另一方面是因为自己原本的protocol（65度0.25M Nacl振摇过夜、37度RNAse 2h、55度蛋白酶K 2h）65度过夜之后会出现小白片、片状沉淀，加了蛋白酶K之后消失。自己年前预实验的时候没有注意是否有这个现象，问了其他人没有这个高温析出蛋白的情况；不知道是否预示着哪里出了问题？ 4.比对了buffer的成分，其实和常用的也挺像，感觉就是浓度低一些，按理说放四度不会有啥变化啊，可也没有别的东西能怀疑了。有没有朋友可以支支招？ 大家有任何建议或提示都请评论，我先谢为敬！！！ |
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2020-05-30 02:46:58, 232.99 K
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2楼2020-05-30 09:32:51
3楼2020-05-30 11:38:58
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猜测，转录因子是属于瞬时转染，同一批样品一个先做一个后做，交联和破碎的时间可能就需要重新摸索下，我们前面做就出现过这样情况，先摸索出的条件在做同一批低温保存了的样品就不行 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2020-06-01 17:06:37
5楼2020-06-02 00:57:04
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大家好，之前老师建议我先往后做IP，做了一次感觉data没有用，做一次挺费抗体的，还是回来摸条件了。 前面叙述中有提到我的裂解液是自己配的，两步裂解之后还要更换自配的超声buffer（0.1%SDS，一共三个buffer）。然后，同学用的裂解液就是最常用的SDS lysis buffer【1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1)】。我分别用了自己的三步裂解液和同学的裂解液、Bioruptor plus和实验室的国产超声仪。结果如下： 链接: https://pan.baidu.com/s/1dAoSHIz5pjDoxodLbRas-w 提取码: cevv 复制这段内容后打开百度网盘手机App，操作更方便哦 换了buffer之后就打下来了，而且片段化基因完全符合后续实验要求，说明自己的三步buffer的确出了问题。 但还有两个疑点： ①如何解释之前解交联成功的超声样品，无法再次解交联？是否冻存的已超声样品中的超声buffer某些成分也同步变质使其交联无法逆转？ ②这次超声cycle对应的是30cycle，之前用自己的buffer在20、25就可以得到更小的片段，难道一开始并没有真的打断DNA？不过也有可能是因为细胞密度不同。 所以，我下一步打算用新配的超声buffer试一下，如果可以，就立即尽快把解交联实验做完，避免样品受超声buffer影响。如果新配的超声buffer不行，跟导师商量一下是不是用1%SDS lysis buffer试试。之前是担心1%SDS会使转录因子的结合位点变性，影响结合；本来结合就比较弱，担心检测不到信号。有没有做过转录因子ChIP的大佬可以在lysis buffer上给点建议呢？ |
6楼2020-06-02 01:22:27
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更新一下，最早之所以用了自己配的配方复杂的裂解液是因为ChIP做的是Tfs，怕kit自带的1% SDS buffer太强。 后来，一楼说的问题解决了，应该是自己配的裂解液失效了，具体原因不明，反正重新配了，超声的胶图就不会出现基因组条带了。 具体的protocol后来也是用的最简单的，和碧云天kit差不多的配方。具体的分享一下： 甲醛交联：0.8% formaldehyde 7min 裂解液：0.2% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.1) 存于室温 超声条件：Bioruptor (Diagenode) with 30 s on and 30 s off at 4℃ on a high power output for 17~18 cycles 5 M NaCl解交联： 65°C旋转孵育>4hr/过夜 2 μl Proteinase K（20mg/ml，碧云天）65°C孵育1 h（正式ChIP样品是500ul体系：加10ul 0.5M EDTA，20ul 1M tris-HCl（pH6.5），2ul蛋白酶K） 至于之前说的小白片的问题，我是先解交联再加蛋白酶K，而师姐是两步一起做的所以没看到小白片。个人猜测是解交联之后析出的蛋白，加完蛋白酶K消化完自然就消失了。 再者就是，除了ChIP-qPCR检测，用qUBIT也能明显看出有没有拉下来DNA，nanodrop测DNA浓度的精度不够。 |
7楼2022-03-23 09:57:59
8楼2022-03-27 14:44:58
