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hht4275

铜虫 (小有名气)

[求助] pTrc99a构的载体转入W3110后,在抗性平板上能长起来,但PCR没有条带是因为什么? 已有2人参与

pTrc99a构的载体转入W3110后,在抗性平板上能长起来,但PCR没有条带是因为什么?抽质粒基本上也抽不出来。未转质粒的W3110在抗性平板上不长 @youlinglyw
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


这个99a载体是tac启动子,表达量还可以,容易行成可溶蛋白

发自小木虫Android客户端
2楼2020-04-15 12:40:05
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
hht4275: 金币+1, 有帮助 2020-04-17 11:25:07
构建的载体经过测序验证吗?
3楼2020-04-16 11:08:08
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ECUST_CAPF

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hht4275: 金币+2, 有帮助 2020-04-17 11:24:42
首先排除一下低级错误:确认质粒是否正确,PCR引物序列是否正确,抗性平板抗性对不对

这个实验你做了几次?如果只做了一次建议重复一下,如果每次都是这样,看一下质粒上的序列是否重组过其他基因
Behind the glory is a loneliness
4楼2020-04-16 11:38:14
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hht4275

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2020-04-16 11:08:08
构建的载体经过测序验证吗?

测过序了,没问题
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5楼2020-04-17 11:21:06
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hht4275

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ECUST_CAPF at 2020-04-16 11:38:14
首先排除一下低级错误:确认质粒是否正确,PCR引物序列是否正确,抗性平板抗性对不对

这个实验你做了几次?如果只做了一次建议重复一下,如果每次都是这样,看一下质粒上的序列是否重组过其他基因

质粒是自己构的,在dh5α里表达还可以,测序结果都没问题
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6楼2020-04-17 11:22:39
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hht4275 at 2020-04-17 11:21:06
测过序了,没问题...

从DH5α抽提的浓度高吗?你有用从DH5α抽提的质粒做模板做过PCR吗?还有,你最终是要转入W3110,可以尝试做这个菌的感受态用来转化。如果你已经重复了多次,PCR和提质粒都无结果,建议你直接从头再来一次,考虑整个过程貌似都没有问题,找不到原因。与其想破脑袋得不到答案不如尽快重新构建。
7楼2020-04-17 18:08:45
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angnay

铜虫 (著名写手)

你好 质粒pTrc99a能馈赠吗?最近表达蛋白好多包涵体 没法做后续酶活~~
8楼2020-06-08 13:04:54
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hht4275

铜虫 (小有名气)

找到原因了,LB中可能会有乳糖,乳糖会导致pTrc99a被诱导表达而复制量很少难以检测,在培养基中加入1~2%的葡萄糖就可以解决了,菌液pcr和抽质粒都没问题了 @youlinglyw
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9楼2020-06-16 15:50:15
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