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XM沐沐新虫 (小有名气)
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[求助]
求助，TA克隆得到的克隆数太低 已有1人参与
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| 设计了400bp的序列，进行TA克隆，转化DH5a感受台态，500ul体系，才得到400左右克隆数，想要得到1000以上的克隆数，应该怎样优化条件呢？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
XM沐沐: 金币+50, ★★★很有帮助 2020-03-29 22:01:02
感谢参与，应助指数 +1
XM沐沐: 金币+50, ★★★很有帮助 2020-03-29 22:01:02
| 不清楚你的具体操作。TA克隆涉及到：T-vector, 你的DNA片段（400 bp那个），DNA连接酶，2×Taq酶。首先你扩增的DNA片段回收的浓度如何，保证浓度比较高，如果是用高保真的酶扩增的，后面没有碱基A，还需要用普通的2×Taq DNA聚合酶末端加A。T-vector理论上用量很少就可以产生大量的克隆，如果你想进一步提高克隆量，可以适量加大T-vector的量。T-vector和DNA片段混合后加入DNA连接酶，连接体系直接转化大肠杆菌。这个链接体系量很少，一般就10ul或者20ul。感受态我们一般自己做的是80ul-100ul，不知道你的500ul 指的感受态体积还是什么体积？没有见过用这么大体积的感受态的。这里另外一个原因就是可能你的感受态效率不高。综上，需要考虑的因素有：片段回收浓度如何，连接过程是否有问题，感受态效果如何。 |
2楼2020-03-29 21:52:38
XM沐沐
新虫 (小有名气)
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3楼2020-03-29 22:00:40