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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 老是得不到我要的重组质粒，都6，7次了，真郁闷
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 老是得不到我要的重组质粒，都6，7次了，真郁闷

各位好，本人最近在做木瓜蛋白酶的克隆实验，目的基因1KB左右，用的是实验室保存的pHsh热激表达载体，PCR后用Stu1 和Hind111双酶切片段和载体（5小时），割胶回收后连接过夜（片段和载体的量大于10：1，我是把片段加的越多越好），1uL电转DH10B后，涂在具有卡那抗性的平板，放在30度培养箱内培养过夜，第二天我提取质粒，有6，7次都是长出东西来了（要么是杂菌，要么是质粒），但我提取后跑胶验证发现什么都没有，但是同样方法去做pHsh纯质粒转化可以长满板，而且提取后跑胶可以得到质粒结果，我真的很奇怪，希望高手指点！！！
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1楼 2009-07-02 23:39:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不要酶切那么久
另外，连接比推荐1：3~1：5，太多反而不好
连接过夜要选择4度过夜而非16度

然后，用好的内切酶NEB或者Fermentas的以及好的连接酶
这些都是关键步骤
有时候是根本没切动，有时候是根本就没连上
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2楼2009-07-03 00:26:53
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
比率1：5---1：8，量不要太大
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3楼2009-07-03 07:41:40
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biosafety

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
估计是酶切的问题，StuI是平末端酶，切割不完全是不好连接的，建议先将PCR产物连接到T载体上，再从T载体上切下来，基本就没问题了。
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科学-哲学-神学-玄学
4楼2009-07-03 09:30:57
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w.king124

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.比例失衡，最好在1：3~1：10之间做几个梯度
2.另外载体一定要切割完全，最好加未切质粒做电泳鉴定，防止假阳性
3.换成4度连接
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5楼2009-07-03 10:14:56
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Charlie1331

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
要先连T载，注意连接酶的最适温度。
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6楼2009-07-03 10:32:30
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wangtengxu

木虫 (正式写手)
你回收完 片段浓度如何？
不用加10倍那么多，但是多应该也可以做出来
因此，可能是你酶切回收后片段质量下降，导致连接不行。

另外，质粒涂板就是很容易长的。
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想和有趣的人一起做有趣的事。
7楼2009-07-03 11:16:53
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linyouhui

铜虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不要郁闷
做实验慢慢来哦
加油
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8楼2009-07-03 11:31:56
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beisimai895

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议楼主先把那二个酶切位点搞清楚，因为有人回贴提到其中一个切出是平端，这样你一个平端，一个粘端连，效率肯定不高。
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9楼2009-07-03 11:37:10
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
我的PCR产物没有纯化就做酶切了,这可能是主要原因吧,请教各位
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10楼2009-07-03 12:01:49
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