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新型冠状病毒的检测与核酸检测试剂盒
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不知道有多少人和笔者一样，每天睁开眼的第一件事就是查看今天的疫情发展情况？为越来越多的人被治愈欣喜，也为那么多的新增确诊忧虑，更为危重患者的去世难过。确实，这场疫情自第一天始就牵动着所有人的心，鼠年的这位不速之客目前已造成了超过7万7千人确诊，超过2500人死亡。不过好消息是，在国家政府和医护人员的全力防治下，目前冠状病毒的新增确诊和疑似正在逐渐减少，治愈率正在快速增加，疫苗的研制也正在有序快速地推进，现已进入动物实验阶段，CountStar细胞分析仪也在多家研发单位贡献着自己的力量，目前这场战役正逐渐迎来曙光。说了这么多，今天笔者和大家来聊一聊这次新型冠状病毒的检测以及大家觉得耳熟的核酸检测试剂盒。 1.新型冠状病毒肺炎患者的检测和确诊 本次冠状病毒感染的潜伏期一般为3-7天，最长可达14天，出现发热不退、乏力和干咳等症状的患者，需要到定点医院进行诊治，一般从问诊到确诊需要经历以下6步，见下图（附件2）。首先是预检分诊，这一步主要是咨询一些流行病史和填写相关表格，这一步对于后期的诊治判断以及疫情过后的流行病调查很重要。接着就是测量体温，如果有发烧的症状需要到发热门诊进行问诊，问诊之后将进行验血和影像学的检查（主要是CT），如果流行病学史和临床检查（包括影像学）的表现都符合，将会被初步判断为疑似病例。 疑似病例将要进行下一阶段的诊断，只要具备以下病原学证据之一者，即可确诊为新型冠状肺炎，第一是呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性，第二是呼吸道标本或血液标本病毒测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。由于测序工作的繁杂性，不符合当前疫情紧急的需要，因此一般将核酸检测阳性作为新型冠状病毒肺炎确诊的标准。 2.核酸检测试剂盒 新型冠状病毒是一种RNA病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒出现后，我国的科学家团队在非常短的时间里完成了对新型冠状病毒全基因组序列的解析，并通过与其它物种的基因组序列对比，发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。通过对患者呼吸道样本和血液样本进行检测，可以甄别出新型冠状病毒阳性的患者，进而确诊。基于以上原理，包括上海之江生物在内的多家企业，紧急攻关，在极端的时间内就研制出了用于检测新型冠状病毒的核酸检测试剂盒，并经国家加紧审批后，上市量产。下图（附件3）是目前国内上市的新型冠形病毒检测试剂盒的企业。 核酸检测试剂盒的原理是荧光定量PCR（RT-PCR），在PCR反应前，首先需要将新型冠状病毒的RNA逆转录为DNA，来作为反应的模板。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针是一段特异性的寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。当反应体系中存在靶标序列的时候，报告基团与淬灭基团会分离，进而发出荧光，反之则不发荧光。荧光量将伴随PCR反应中靶标序列的扩增而逐渐增强，达到设定的阈值时，所需要的循环数（Ct值）会被记录下来，Ct值和样本中病毒核酸的含量呈现负相关，Ct值越小，病毒含量越高。 3.核酸检测试剂盒的检测流程 对患者的病人进行核酸检测，一般需要进行以下几个流程。首先是病人标本的采集，本次新型冠状病毒可供检测的标本包括：上呼吸道标本，下呼吸道标本，血液标本和血清标本等。采集方法有咽拭子，鼻拭子，鼻炎呼吸道抽取物，吼支气管灌洗液以及血液血清提取等，其中咽拭子和鼻拭子是较为简单和常用的采取方法，但是存在提取物中病毒含量低的问题；标本提取后，需要进行的是标本的保存和运输，对于24小时内检测的标本，可4℃保存，若无法在24小时内检测，需在-70℃或液氮内保存，以避免RNA降解；第三步是对病人样本进行核酸的抽提，以提取标本中的病毒核酸，并将提取的核酸进行浓度和纯度检测；第四步需要利用逆转录酶将RNA逆转录为DNA，三四步操作都需使用无RNA酶的器具耗材，以避免RNA降解；最后一步则是利用特异性的引物和Taqman荧光探针在荧光定量PCR仪中进行病毒核酸含量的相对定量检测，本次新型冠状病毒常用的引物和探针见下图（附件5）。荧光量达到阈值的CT值，将被作为判断新型冠状病毒是否感染的标准，一般情况下，若Ct值大于40或无CT值（NA），则结果为阴性，若Ct值<37，则认定结果为阳性，若Ct值介于37和40之间，则结果为可疑的，可能是本底的核酸背景，也有可能是核酸提取的问题，需要重新进行检测。不同公司的产品，可能对于阳性标准的判定会略有不同，但都基本依据Ct值的大小。 4.核酸检测试剂盒检测新型冠状病毒仍存在的一些问题 虽然核酸检测试剂盒的准确性和灵敏性很高，但是仍然存在检测假阳性和假阴性的情况，也有一些经过多次测核酸检测才确认的病例见诸报道。原因有很多，首先是试剂盒研发时间仓促，产品审批紧急，导致部分产品稳定性不够高；其次，不同厂家生产的试剂盒的质量也存在参差不齐的问题；第三是由于患者核酸采样的局限性，一般采取的样本是口鼻咽的分泌物，但是口咽部的病毒含量与呼吸道也会存在差异；第四，采样人员可能存在的人为误差，也会影响最终的检测结果；最后，新型冠状病毒对人体器官侵害的特异性也存在差异。因此，对于新型冠形病毒的检测，仍需配合流行病史、临床表征和影像学的结果，来进行综合的判断。 纵然仍有很多困难，但是一切正在好转，疫情逐步得到了控制，患者也都能获得及时有效的收治，相信过不了多久，武汉又能成为热腾腾的热干面，而我们也都能在阳光下，自由的撸串，火锅，炸鸡，打牌，搓麻将…是不是想想还有些小激动呢。 最后，CountStar祝大家平安健康，早日度过本次的疫情难关！  附件1.png  附件2.png  附件3.png  附件4.png  附件5.png |
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