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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 减少引物二聚体的方法
汕头大学海洋科学接受调剂
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zmj0630

金虫 (小有名气)

[交流] 减少引物二聚体的方法

1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数；
9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；
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1楼 2009-06-28 14:08:16
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zhyzx

金虫 (小有名气)
学习啦！谢谢楼主啊！
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2楼2009-06-28 14:47:05
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香菱儿
3楼2009-06-28 21:27:18
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gene112

金虫 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zmj0630 at 2009-6-28 14:08:
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引 ...

多谢共享。
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你来，我必在；你若倾诉，我必倾听！
4楼2009-06-28 22:42:15
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wangtengxu

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
厉害
其中一些深有体会

加一条：降低引物浓度
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想和有趣的人一起做有趣的事。
5楼2009-06-28 23:17:09
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)
不错 经验之谈
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6楼2009-06-29 10:15:42
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playboy723

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
呵呵   可以在反应温度高于80度之后再加tag酶   引物二聚体很大的一部分原因就是在冰上的时候就加tag酶   这样很容易就在低温时就发生扩增  当然模版就是引物本身了  呵呵  当然  实在不行的话换引物也是一种好的方法
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7楼2009-06-29 10:32:43
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max_518

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
受教了
以后可以试试~
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8楼2009-07-07 18:11:07
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ly888lsp

木虫 (小有名气)
加一些抑制剂可能更好
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9楼2009-07-07 18:30:09
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gskekeai

木虫 (正式写手)
学习一下！！谢谢！！
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10楼2009-07-08 11:09:41
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