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XM沐沐新虫 (小有名气)
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关于质粒重组，请教大佬们~ 已有2人参与
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| 合成的引物，退火用klenow fragment补齐，酶切后用T4连接酶插入到相同酶切的质粒中，通过DH5α转化，没有菌落长出，是什么问题啊？是质粒重组没有连接上么？ |
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2楼2020-01-16 13:03:42
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3楼2020-01-17 13:32:24
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【答案】应助回帖
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导致没有菌生长的原因有很多，比如，片段酶切处理不完全、载体处理不完全、连接效率过低、感受态细胞效率低下等等。如果想找到原因还是建议做一些对照实验，比如可以用空载转感受态，验证感受态细胞效率，通过载体自连转化验证载体处理效果等。 大家经常面对的是假阳性比较多，即载体自连。对于楼主出现的连一个菌都不长的情况，首先确定平板抗性正确，然后使用空载体进行转化，验证感受态细胞的效率，当然如果感受态细胞其他人用着可以，那就不用做该对照。 不太清楚楼主的实验目的，描述的比较简单，且“合成的引物，退火用klenow fragment补齐”是pcr扩增基因产物？我没做过，所以不太清楚表达的意思。 其实转化的主要因素就是：片段、载体、连接体系 pcr片段进行酶切时候，最容易出现酶切不完全的情况，因为切下来的碱基少，电泳无法分辨。可以考虑连接T载体后，提取质粒进行酶切，这样可以通过电泳检测片段是否酶切完全。 载体也同样存在酶切是否完全的问题，特别双酶切的时候，很多判断是否两个酶都酶切完全。这时候我们一般会适当的增加酶量和时间，但这一般不会导致一个菌都不长，会出现载体自连情况。 接下来就是连接，我建议在进行片段和载体连接前，一定进行电泳检测你的片段和载体浓度，因为我们之前就出现过，对片段载体胶回收后进行连接效率很低，后来发现回收的片段浓度电泳都看不到，所以根据经验，还是做个电泳检测，如果片段浓度可以，那就尽量多的加入片段，载体有一点即可，可以增加转化子的阳性数。 |
4楼2020-04-08 14:26:18
