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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 金黄色葡萄球菌质粒提取问题
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linglan2612

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by dailei1983 at 2009-6-24 15:46:



谢谢，我看了一个论文里也是这么做的，我试试看。不知你有没有做过大提呢，我是用的100mlLB摇的菌液，还有请问一下你加溶菌酶和溶葡萄球菌素的浓度都是多大啊。

做过大提，也是100毫升，是将我的目的基因上到pMAD载体上，然后转金葡RN4220菌（修饰菌株），然后从RN4220里提质粒转标准株或临床株。提的时候是先用苯酚氯仿异戊醇抽提，然后将抽提所得上清上到TIANGEN的质粒提取试剂盒的柱子上，用去蛋白液再洗一次，接下来就用试剂盒里的漂洗液洗柱子……效果还好，但是的确不能和G-菌提质粒的质量相比，不过已经够酶切用了哦。
不知道您下游准备做什么工作，其实我也是微生物的新手，做分子生物学的实验仅1年的时间，许多方法并不一定对，希望能对您的实验有一点点帮助而不是添乱，嘿嘿。
另外溶葡球菌酶的浓度是1mg/mL,普通溶菌酶的浓度是50mg/mL
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任务分解，做好计划，减少情绪对抗
11楼2009-06-25 10:45:55
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-6-24 16:50:
翻到文献了,o(∩_∩)o...上传到nami盘了,链接如下:

http://www.namipan.com/d/2089.pd ... 7ecc573bc3fad490700

很有帮助，谢谢！
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12楼2009-06-25 11:55:29
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
如果抗氯霉素，可以用氯霉素刺激增加拷贝数
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13楼2009-06-25 14:13:29
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linglan2612 at 2009-6-25 10:45:


做过大提，也是100毫升，是将我的目的基因上到pMAD载体上，然后转金葡RN4220菌（修饰菌株），然后从RN4220里提质粒转标准株或临床株。提的时候是先用苯酚氯仿异戊醇抽提，然后将抽提所得上清上到TIANGEN的质粒 ...

我是做细菌耐药性的，提取质粒后把质粒电转化到RN4220里，用抗生素筛选含有耐药基因质粒的RN4220电转子，再提取耐药质粒做下游的实验。其他种的葡萄球菌还行，就是金黄色葡萄球菌提的效果不好。我是用的qiagen小提和中提的盒子。
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14楼2009-06-25 14:21:25
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
我提质粒是按照qiagen说明书上说的挑取单克隆到1ml 含抗生素LB中，活化8小时之后，吸取100微升到100毫升含抗生素LB中，250rpm震摇12小时到对数生长期后期提取质粒。按照说明书上说12-16小时收集下来的沉淀大概是3g/L培养基，我今天按我100ml收集的菌液沉淀换算一下，足有11g/L培养基，远高于它的要求。下次我只取30ml菌液离心收集沉淀再提一下，看会不会好点。
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15楼2009-06-25 14:37:59
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