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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 金黄色葡萄球菌质粒提取问题
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dailei1983

金虫 (初入文坛)

[交流] 金黄色葡萄球菌质粒提取问题

最近一直在做葡萄球菌质粒的提取，第一步裂解用过溶菌酶，也用过溶葡萄球菌素（lysostaphin），但就是效果不太好。我要提的质粒是耐药菌株的质粒，不是工程质粒，比较大，估计拷贝数也比较低。大家有做过的能不能介绍一下经验，有哪些关键环节值得注意呢？十分感谢！
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1楼 2009-06-23 16:06:32
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
我提质粒是按照qiagen说明书上说的挑取单克隆到1ml 含抗生素LB中，活化8小时之后，吸取100微升到100毫升含抗生素LB中，250rpm震摇12小时到对数生长期后期提取质粒。按照说明书上说12-16小时收集下来的沉淀大概是3g/L培养基，我今天按我100ml收集的菌液沉淀换算一下，足有11g/L培养基，远高于它的要求。下次我只取30ml菌液离心收集沉淀再提一下，看会不会好点。
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15楼2009-06-25 14:37:59
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
拷贝数低的话尝试一下培养时加青霉素可以提高拷贝数
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平和悦衲！
2楼2009-06-23 18:48:13
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
我在LB里添加了抗生素，但是效果还是不明显。我觉得主要问题在裂解这一步。金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有细胞壁，不像大肠杆菌可以直接进行碱裂解，而是在裂解前加入溶菌酶或溶葡萄球菌素破壁再按常规操作。但是我都试过了，效果很不好，不是裂解不完全，就是最后质粒提出来有降解，其他葡萄球菌还好，就是金黄色葡萄球菌怎么都提不出来。真郁闷！
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3楼2009-06-23 22:36:03
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林祎

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以增加裂解液的量延长裂解时间
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4楼2009-06-23 23:34:26
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