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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 金黄色葡萄球菌质粒提取问题
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dailei1983

金虫 (初入文坛)

[交流] 金黄色葡萄球菌质粒提取问题

最近一直在做葡萄球菌质粒的提取，第一步裂解用过溶菌酶，也用过溶葡萄球菌素（lysostaphin），但就是效果不太好。我要提的质粒是耐药菌株的质粒，不是工程质粒，比较大，估计拷贝数也比较低。大家有做过的能不能介绍一下经验，有哪些关键环节值得注意呢？十分感谢！
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质粒提取

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1楼 2009-06-23 16:06:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dailei1983

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linglan2612 at 2009-6-24 11:34:
我之前做的时候也同样遇到类似的问题，有一点点体会就是菌体量不能太大，比如摇5毫升的菌液，收集菌体时就分别收集在5个EP管里，把普通溶菌酶和溶葡球菌酶都加，作用的时间也相应延长，然后用试剂盒提，一般去蛋白 ...

谢谢，我看了一个论文里也是这么做的，我试试看。不知你有没有做过大提呢，我是用的100mlLB摇的菌液，还有请问一下你加溶菌酶和溶葡萄球菌素的浓度都是多大啊。
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7楼2009-06-24 15:46:34
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
拷贝数低的话尝试一下培养时加青霉素可以提高拷贝数
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平和悦衲！
2楼2009-06-23 18:48:13
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
我在LB里添加了抗生素，但是效果还是不明显。我觉得主要问题在裂解这一步。金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有细胞壁，不像大肠杆菌可以直接进行碱裂解，而是在裂解前加入溶菌酶或溶葡萄球菌素破壁再按常规操作。但是我都试过了，效果很不好，不是裂解不完全，就是最后质粒提出来有降解，其他葡萄球菌还好，就是金黄色葡萄球菌怎么都提不出来。真郁闷！
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3楼2009-06-23 22:36:03
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林祎

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以增加裂解液的量延长裂解时间
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4楼2009-06-23 23:34:26
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linglan2612

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-24 15:55
我之前做的时候也同样遇到类似的问题，有一点点体会就是菌体量不能太大，比如摇5毫升的菌液，收集菌体时就分别收集在5个EP管里，把普通溶菌酶和溶葡球菌酶都加，作用的时间也相应延长，然后用试剂盒提，一般去蛋白液会洗2次，最后过柱时就将5管的上清只过一个柱子，再进行最后的洗脱，呵呵，还是有一点点进步的哦。希望能对你有点点帮助，嘿嘿。
赞一下(7人) 回复此楼
任务分解，做好计划，减少情绪对抗
5楼2009-06-24 11:34:33
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
amisking(金币+1,VIP+0):呵呵，赶紧帮忙找找哦！ 6-24 15:56
我记得看过nature protocol还是proceeding上的一篇文献,里面也是大质粒的提取,一个改进的方法,回头帮你找找看
赞一下(6人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
6楼2009-06-24 13:51:33
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-6-24 13:51:
我记得看过nature protocol还是proceeding上的一篇文献,里面也是大质粒的提取,一个改进的方法,回头帮你找找看

十分感谢！
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8楼2009-06-24 15:47:06
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dailei1983

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 林祎 at 2009-6-23 23:34:
可以增加裂解液的量延长裂解时间

谢谢！
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9楼2009-06-24 15:52:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
翻到文献了,o(∩_∩)o...上传到nami盘了,链接如下:

http://www.namipan.com/d/2089.pd ... 7ecc573bc3fad490700
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
10楼2009-06-24 16:50:06
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