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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR目的条带比较微弱？（附图）
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)

[交流] PCR目的条带比较微弱？（附图）

PCR目的条带比较微弱，最有可能是哪个地方出现问题呢？我的反应体系（20ul）及条件如下：
10×buffer    2ul
F引物      0.4ul
R引物      0.4ul
dNTP            0.4ul
Taq酶       0.3ul
模版        2ul
ddH2O          14.5ul

94°预变性5min，94° 50s
                           64° 30s
                           72° 1min     
最后72°延伸10min，一共35个循环.电泳图如下，请大家帮我分析分析，谢谢！
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1楼 2009-06-22 15:43:52
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350784478

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是你的目的基因表达量低，你可以再跑一次巢式PCR，看看结果是怎么样的。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
2楼2009-06-22 16:07:04
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不知道你是为了检测还是为了回收？检测就够用了。如果回收，就用pcr产物再做一次pcr，然后胶回收，目的片段
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3楼2009-06-22 16:54:58
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weilin2378

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以试一试降低退火温度。如果还不行，可以减少模板DNA，试一下0.5微升，因为模板浓度太高也可能抑制PCR反应。
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4楼2009-06-22 20:29:53
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yanlili

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是退火温度比较高，特异性好，但相应的产物的量会减少
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5楼2009-06-23 10:17:23
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j2

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
Mg离子浓度呢？高了低了都会影响的~
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
6楼2009-06-23 10:28:03
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
我主要是回收，那我再降低一下退火温度，顺便减少点模版DNA的量再试试！
谢谢大家！
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7楼2009-06-23 10:48:33
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smallcat227

木虫 (著名写手)
对的，降退火温度，稀释模板10-100倍
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8楼2009-06-23 19:02:49
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shirley7216

木虫 (小有名气)
加大模板量试试
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simon
9楼2009-06-24 00:07:05
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
设计几个退火温度，用梯度PCR进行PCR，挑选最适的退火温度。
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平和悦衲！
10楼2009-06-24 09:03:46
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