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gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 有关DNA酶切的问题

PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问:
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗?
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗?
3.如果需要割胶纯化的话,为了方便后面的连接,PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢?
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yanlili

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
其实一般有酶切位点的话都不连T载的,浪费时间和物力。回收一定要好好做,避免污染以及酶切不完全的情况,比例已经说过了,一般质粒的量保证在20-60ng,太多了不好,但是太少了也不好。
9楼2009-06-23 10:39:39
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可以切,但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上,转化,提质粒,再用酶切。再胶回收酶切产物。再练,可以避免很多说不清的麻烦
2楼2009-06-21 19:49:12
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figo.339

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问:
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗?
   最好纯化后酶切。
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗?
   割胶纯化
3.如果需要割胶纯化的话,为了方便后面的连接,PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢?
  载体与片段的摩尔比在1:3-1:8,最好1:5.
4楼2009-06-21 20:28:38
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gastrodia

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by dyyyyy at 2009-6-21 19:49:
可以切,但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上,转化,提质粒,再用酶切。再胶回收酶切产物。再练,可以避免很多说不清的麻烦

我倒没有想到,确实T载体克隆转化,再提质粒就不怕PCR产物量太少了,谢谢啊
5楼2009-06-21 20:43:22
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