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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有关DNA酶切的问题
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gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 有关DNA酶切的问题

PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问：
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗？
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗？
3.如果需要割胶纯化的话，为了方便后面的连接，PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢？
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1楼 2009-06-21 19:24:39
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yanlili

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实一般有酶切位点的话都不连T载的，浪费时间和物力。回收一定要好好做，避免污染以及酶切不完全的情况，比例已经说过了，一般质粒的量保证在20-60ng，太多了不好，但是太少了也不好。
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9楼2009-06-23 10:39:39
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以切，但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上，转化，提质粒，再用酶切。再胶回收酶切产物。再练，可以避免很多说不清的麻烦
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2楼2009-06-21 19:49:12
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figo.339

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问：
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗？
   最好纯化后酶切。
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗？
   割胶纯化
3.如果需要割胶纯化的话，为了方便后面的连接，PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢？
  载体与片段的摩尔比在1：3-1：8，最好1：5.
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4楼2009-06-21 20:28:38
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gastrodia

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dyyyyy at 2009-6-21 19:49:
可以切，但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上，转化，提质粒，再用酶切。再胶回收酶切产物。再练，可以避免很多说不清的麻烦

我倒没有想到，确实T载体克隆转化，再提质粒就不怕PCR产物量太少了，谢谢啊
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5楼2009-06-21 20:43:22
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