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gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 有关DNA酶切的问题

PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问:
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗?
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗?
3.如果需要割胶纯化的话,为了方便后面的连接,PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢?
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figo.339

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问:
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗?
   最好纯化后酶切。
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗?
   割胶纯化
3.如果需要割胶纯化的话,为了方便后面的连接,PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢?
  载体与片段的摩尔比在1:3-1:8,最好1:5.
4楼2009-06-21 20:28:38
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可以切,但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上,转化,提质粒,再用酶切。再胶回收酶切产物。再练,可以避免很多说不清的麻烦
2楼2009-06-21 19:49:12
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gastrodia

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by dyyyyy at 2009-6-21 19:49:
可以切,但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上,转化,提质粒,再用酶切。再胶回收酶切产物。再练,可以避免很多说不清的麻烦

我倒没有想到,确实T载体克隆转化,再提质粒就不怕PCR产物量太少了,谢谢啊
5楼2009-06-21 20:43:22
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anik

银虫 (正式写手)

一般来讲都是通过连接T克隆载体,经过菌体自我复制,这个步骤有两个好处,1、生物体的自我复制要比人为的复制精确;2、测序!
如果不需要测序,那么PCR产物可以直接进行酶切,只是PCR的混合液会对内切酶有影响。纯化后效果好些,同时内切酶识别位点前段的碱基数量对内切酶的识别也有影响,通常情况下,3-4最好。

其他问题已有人给你回答了。

多看文献,这类问题在文献中都有解答的。看别人是怎么做的。
7楼2009-06-22 08:04:04
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