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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有关DNA酶切的问题
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gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 有关DNA酶切的问题

PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问：
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗？
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗？
3.如果需要割胶纯化的话，为了方便后面的连接，PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢？
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1楼 2009-06-21 19:24:39
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以切，但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上，转化，提质粒，再用酶切。再胶回收酶切产物。再练，可以避免很多说不清的麻烦
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2楼2009-06-21 19:49:12
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dongjiqiao

铁杆木虫 (著名写手)
同楼上~~~~
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long,longlong.
3楼2009-06-21 20:04:23
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figo.339

木虫 (著名写手)
★
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PCR产物需要经过双酶切与同样双酶切的表达质粒相连
请问：
1.PCR产物不经纯化可以直接酶切吗？
   最好纯化后酶切。
2.酶切之后的PCR产物和质粒需要割胶纯化吗？
   割胶纯化
3.如果需要割胶纯化的话，为了方便后面的连接，PCR产物和质粒在电泳时上样大概用多少微克呢？
  载体与片段的摩尔比在1：3-1：8，最好1：5.
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4楼2009-06-21 20:28:38
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gastrodia

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dyyyyy at 2009-6-21 19:49:
可以切，但效果不一定好。我个人经验是把pcr产物连到t载体上，转化，提质粒，再用酶切。再胶回收酶切产物。再练，可以避免很多说不清的麻烦

我倒没有想到，确实T载体克隆转化，再提质粒就不怕PCR产物量太少了，谢谢啊
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5楼2009-06-21 20:43:22
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study236

银虫 (小有名气)
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6楼2009-06-21 23:14:52
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anik

银虫 (正式写手)
一般来讲都是通过连接T克隆载体，经过菌体自我复制，这个步骤有两个好处，1、生物体的自我复制要比人为的复制精确；2、测序！
如果不需要测序，那么PCR产物可以直接进行酶切，只是PCR的混合液会对内切酶有影响。纯化后效果好些，同时内切酶识别位点前段的碱基数量对内切酶的识别也有影响，通常情况下，3-4最好。

其他问题已有人给你回答了。

多看文献，这类问题在文献中都有解答的。看别人是怎么做的。
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7楼2009-06-22 08:04:04
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gastrodia

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by anik at 2009-6-22 08:04:
一般来讲都是通过连接T克隆载体，经过菌体自我复制，这个步骤有两个好处，1、生物体的自我复制要比人为的复制精确；2、测序！
如果不需要测序，那么PCR产物可以直接进行酶切，只是PCR的混合液会对内切酶有影响。 ...

文献倒是看了很多，但多数都是很含糊，几句话就一带而过了，也可能没有看到合适的
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8楼2009-06-22 16:52:43
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yanlili

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
其实一般有酶切位点的话都不连T载的，浪费时间和物力。回收一定要好好做，避免污染以及酶切不完全的情况，比例已经说过了，一般质粒的量保证在20-60ng，太多了不好，但是太少了也不好。
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9楼2009-06-23 10:39:39
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