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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 土壤DNA提取
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hbxjh1984

铜虫 (初入文坛)

[交流] 土壤DNA提取

提取土壤总DNA：
方法：1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂，液氮研磨；
           2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h；
           3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；
           4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；
            5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；
            6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；
             7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；
             8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。
            土样比较特殊，黑色，腐殖质等物质含量高，提了三次，每次电泳仅见色素很亮，无DNA，PCR扩增也无目的片段，请各位大侠帮忙诊断诊断！
            DNA提取液组成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0
            以上为三次提取的详细过程及试剂用量。

[ Last edited by hbxjh1984 on 2009-6-18 at 17:44 ]
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1楼 2009-06-18 17:41:58
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hbxjh1984(金币+5,VIP+0): 6-19 12:29
hbxjh1984(金币+2,VIP+0): 6-30 16:16
呵呵，我恰好做过这个，可以给你些建议。我是按照 周集中的方法做的，也就是楼上发的那个AEM文献。
1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂，液氮研磨；

不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以在这步加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min，弃上清。


           2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h；
这步你在37度摇床时间我个人觉得太长了，可以参考文献30min足矣。

           3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；
           4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；
          这里可以考虑再增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。

            5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；

我在做抽提的时候加用了一步酚氯仿，原因是酚能够更好的使蛋白变性。如果不考虑用酚的话，建议你用氯仿异戊醇抽提两次。你会发现颜色会变清不少。
            6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；
   这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。

             7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；
             8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。
  
这步沉淀贴壁很紧，不要用小枪头吹吸搅动，可以将沉淀浸没后放置于4度过夜或数小时，沉淀就会蓬松。
            土样比较特殊，黑色，腐殖质等物质含量高，提了三次，每次电泳仅见色素很亮，无DNA，PCR扩增也无目的片段，请各位大侠帮忙诊断诊断！
       这个是必须纯化的，你的样品里面太多的多糖类物质和腐殖质。不纯化想PCR哪里有那么好的事情啊。可以选择qiagen的40KB的胶回收试剂盒，嫌太贵的话可以考虑电洗脱。当然不止这两种纯化方法，你可以查些文献
            DNA提取液组成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0
            以上为三次提取的详细过程及试剂用量。

最后想问问你是要构建文库呢还是就是p 16S呢？要是后者的话我个人觉得没有必要用直接提取DNA的方法，要是建库的话另论。

对了，里面还有一些小的注意事项，比如所有的枪尖，包括1mL的都要去尖后灭菌。每个步骤动作都要轻柔，这样DNA才会完整。

祝好运

[ Last edited by brightfuture01 on 2009-6-19 at 00:20 ]
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
6楼2009-06-19 00:13:15
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
谢谢~啊
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2009-06-18 19:40:55
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weilin2378

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-18 20:27
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-18 20:48
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-30 16:15
土壤DNA的提取可以参照Zhou的方法（DNA recovery from soils of diverse composition，Appl. Environ. Microbiol.，1996，62，316-322）. 提取后DNA的纯化可参考Jackson的方法（A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples，Appl. Environ. Microbiol.，1997，63，4993-4995）。

另外还可以购买试剂盒。我用过SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 和UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO), 都不错。
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3楼2009-06-18 20:22:15
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zlp322

铜虫 (初入文坛)
弱弱问一下，提土壤宏DNA是作什么用的啊？
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4楼2009-06-18 20:25:58
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weilin2378

木虫 (小有名气)
一般是研究微生物的多样性；也可以用来构建metagenomic library，获取大片段DNA或目的基因。
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5楼2009-06-18 20:28:30
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yefayin

金虫 (小有名气)
拜读上述文字，颇受启迪。
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7楼2009-06-19 09:17:35
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林祎

木虫 (正式写手)
楼主的方法不能得到大于50KB的片段
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8楼2009-06-19 10:11:26
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hbxjh1984

铜虫 (初入文坛)

巨感谢5楼

直接提DNA的目的分析多样性，虽然方法不是建库，但是要求尽量都提出环境总DNA。我前面用同样的方法提取同样环境的DNA，已经完成了克隆文库的构建及分析，这次是新采集的样品，做一些新东西，需要DNA的量大，质量好，片段>23kb就行了。根据前三次提取的过程表现看，和以前没有什么不同，第一次室温离心上层有大量的蛋白，破壁等应该完全了......真搞不懂！上周提的两次我都用TENP缓冲液、PBS缓冲液洗了，也没提出来。郁闷ing
再次谢谢你的方法，我下来再试试。
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9楼2009-06-19 12:42:37
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ouqiaoming

木虫 (正式写手)
★ ★
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-21 13:27
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-30 16:16
支持2楼的答案，我也用这个方法，效果还不错
土壤DNA的提取可以参照Zhou的方法（DNA recovery from soils of diverse composition，Appl. Environ. Microbiol.，1996，62，316-322）. 提取后DNA的纯化可参考Jackson的方法（A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples，Appl. Environ. Microbiol.，1997，63，4993-4995）。

另外还可以购买试剂盒。我用过SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 和UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO), 都不错。
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10楼2009-06-20 02:26:04
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