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hbxjh1984

铜虫 (初入文坛)

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专业: 极端环境微生物

[交流] 土壤DNA提取

提取土壤总DNA：
方法：1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂，液氮研磨；
         2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h；
         3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；
         4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；
         5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；
         6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；
         7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；
         8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。
         土样比较特殊，黑色，腐殖质等物质含量高，提了三次，每次电泳仅见色素很亮，无DNA，PCR扩增也无目的片段，请各位大侠帮忙诊断诊断！
         DNA提取液组成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0
         以上为三次提取的详细过程及试剂用量。

[ Last edited by hbxjh1984 on 2009-6-18 at 17:44 ]

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1楼 2009-06-18 17:41:58

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林祎

木虫 (正式写手)

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8楼2009-06-19 10:11:26

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weilin2378

木虫 (小有名气)

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★ ★ ★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-18 20:27
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-18 20:48
hbxjh1984(金币+1,VIP+0): 6-30 16:15

土壤DNA的提取可以参照Zhou的方法（DNA recovery from soils of diverse composition，Appl. Environ. Microbiol.，1996，62，316-322）. 提取后DNA的纯化可参考Jackson的方法（A simple, efficient method for the separation of humic substances and DNA from environmental samples，Appl. Environ. Microbiol.，1997，63，4993-4995）。

另外还可以购买试剂盒。我用过SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 和UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO), 都不错。

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3楼2009-06-18 20:22:15

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